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May 05, 2023

Andamios eléctricamente conductores que imitan la estructura jerárquica de las miofibras cardíacas

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 2863 (2023) Citar este artículo

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Detalles de métricas

Los andamios eléctricamente conductores, que imitan la alineación direccional única de las fibras musculares en el miocardio, se fabrican utilizando la técnica de microestereolitografía de impresión 3D. El diacrilato de polietilenglicol (polímero fotosensible), Irgacure 819 (fotoiniciador), curcumina (colorante) y polianilina (polímero conductor) se mezclan para hacer la tinta conductora que se entrecruza mediante una reacción de fotopolimerización de radicales libres. La curcumina actúa como un filtro líquido y evita que la luz penetre profundamente en la solución fotosensible y juega un papel central en el proceso de impresión 3D. Los andamios obtenidos muestran una morfología bien definida con un tamaño medio de poro de 300 ± 15 μm y propiedades semiconductoras con una conductividad de ~ 10–6 S/m. Los análisis de voltamperometría cíclica detectan la electroactividad y destacan cómo la transferencia de electrones también implica una difusión iónica entre el polímero y la solución electrolítica. Los andamios alcanzan su grado máximo de hinchamiento 30 min después de sumergirlos en PBS a 37 °C y después de 4 semanas muestran una tasa de degradación hidrolítica lenta típica de la red de polietilenglicol. Los andamios conductivos muestran una conductividad ajustable y proporcionan un entorno óptimo para las células progenitoras cardíacas de ratón cultivadas.

Los tejidos biológicos generalmente se clasifican por los tipos de células incrustados en su textura, la expresión de diferentes moléculas que contribuyen a su maquinaria y las familias de factores secretados en varios pasos de su diferenciación. Sin embargo, también son atravesados ​​por débiles corrientes eléctricas cruciales para su comunicación y funcionamiento intercelular1. En el miocardio y los nervios, estas corrientes basales se superponen a ondas eléctricas cíclicas autogeneradas capaces de generar señales y fuerzas mecánicas que, a través de células adyacentes, viajan a las regiones más periféricas del cuerpo. En este contexto, la función del tejido miocárdico está modulada por las propiedades mecánicas únicas y la estructura anisotrópica del tejido cardíaco en el que la amplia red tridimensional de matriz extracelular (MEC) orienta a los cardiomiocitos, los acopla mecánicamente asegurando su conectividad eléctrica y Proporciona soporte elástico durante la contracción ventricular. La orientación de las fibras miocárdicas varía transmuralmente a lo largo de la pared ventricular. Estas fibras corren en la dirección de la hélice dextrógira en la región subendocárdica, pasan circunferencialmente a través de la pared media y giran en la dirección de la hélice dextrógira en la región subepicárdica, contribuyendo significativamente al bombeo cardíaco2,3. Los eventos traumáticos y las enfermedades degenerativas, entre otras, a menudo conducen a daños irreparables en esta admirable bioarquitectura debido a la pobre capacidad de regeneración innata del corazón4. Las áreas lesionadas se reemplazan con tejido cicatricial rico en colágeno que deforma la geometría ventricular y obstruye el flujo regular de señales eléctricas, lo que provoca arritmias e insuficiencia cardíaca a largo plazo5.

En las últimas décadas, el progreso en las ciencias biológicas, la ingeniería, la ciencia de los materiales y las técnicas avanzadas de micro/nanofabricación han sugerido la posibilidad de reparar las regiones ventriculares lesionadas mediante la fabricación e implantación de tiras de miocardio sano. Con este fin, se ha empleado un enfoque multidisciplinario (ingeniería de tejidos) para igualar la complejidad de la bioarquitectura y función del tejido miocárdico. En un experimento típico de ingeniería de tejidos, las células madre se siembran en un andamio polimérico biocompatible que emula vagamente la MEC del tejido. El andamio suele estar compuesto de biomaterial natural o sintético o una combinación de ambos (andamio) y con este enfoque se han diseñado e implantado in vivo varios tejidos artificiales similares a un corazón6,7,8,9,10,11. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos extraordinarios a nivel mundial, los resultados aún no han sido adecuados para vislumbrar el uso clínico12,13. La causa de esta falla, entre otras, se puede encontrar mayoritariamente en andamios que mimetizan inadecuadamente la bioarquitectura tisular14. Inicialmente, los andamios estaban destinados simplemente como un soporte mecánico para que las células cultivadas crecieran y proliferaran. Posteriormente, se reveló que la diferenciación celular se puede mejorar a través de propiedades físicas, químicas, mecánicas y biológicas específicas del andamio mientras se espera que las células secreten su propia MEC.

Se puede encontrar abundante literatura sobre andamios que demuestran algunas o todas estas propiedades15,16,17,18. Sin embargo, dos cuestiones principales no se han abordado de forma adecuada en los andamios actualmente en uso que de otro modo no serían eléctricamente conductores. El primero es cómo conferir al andamio la capacidad de inducir la orientación adecuada de los cardiomiocitos. El segundo es cómo la creación de un entorno electroconductor puede mejorar la comunicación intercelular y la sincronización entre las células madre cardíacas inmaduras que sufren de conductividad reducida debido a una organización aún deficiente de las uniones comunicantes.

Las uniones comunicantes son estructuras de la membrana celular que permiten el intercambio rápido de iones, lo cual es necesario para la propagación eficiente de los potenciales de acción a través de la pared del corazón y la propagación de las moléculas de señalización. Sin embargo, las uniones comunicantes en los cardiomiocitos humanos se distribuyen por toda su superficie celular durante las etapas neonatales y alcanzan su maduración y polarización final en los discos intercalados solo cuando los seres humanos tienen 6 años de edad19. Se observó una distribución similar en murinos y caninos donde las uniones gap alcanzaron su madurez y polarización solo cuando los animales tenían 90 días de edad20. Estos datos sugieren que la electroconductividad miocárdica está asociada con dos redes eléctricas diferentes: la primera está activa durante los primeros años de vida, se basa en la ECM y contribuye en gran medida a la señalización de las células inmaduras en desarrollo. Mientras que el segundo se basa típicamente en los cardiomiocitos maduros, transmite el estímulo para la contracción y tiene un efecto pobre sobre el fenotipo celular cuando se establece.

A partir de estudios previos sobre métodos innovadores para preparar biomateriales y biosistemas21,22,23, el objetivo principal del presente estudio fue desarrollar andamios eléctricamente conductores que imitaran la orientación jerárquica de las miofibras cardíacas utilizando un enfoque de microestereolitografía de proyección de impresión 3D desde una perspectiva técnica.

La conductividad se logró mezclando el polímero conductor polianilina (PANI) con hidrogeles de polietilenglicol diacrilato (PEGDA) para hacer una tinta conductora para impresión 3D. Los andamios obtenidos demostraron propiedades semiconductoras (~ 10–6 S/m) con un tamaño medio de poro de 300 ± 15 μm. La conductividad se puede adaptar fácilmente controlando la concentración de PANI en la solución precursora. La viabilidad de las células progenitoras cardíacas de ratón cultivadas en andamios conductores fue comparable a la de las células cultivadas en andamios no conductores.

Todos los reactivos se adquirieron de Merck KGaA, excepto cuando se indique lo contrario, y se usaron tal como se recibieron.

PANI se sintetizó siguiendo un protocolo previamente optimizado24. En resumen, después de la destilación a presión reducida, se añadieron 5 mmol de anilina (Fluka) a una solución de HCl 1 M que contenía una cantidad adecuada de dodecilsulfato de sodio (SDS) y se sonicó durante 30 min. Paralelamente, se añadieron 5 mmol de persulfato de amonio a otra solución de HCl 1 M. Esta mezcla se añadió lentamente a la mezcla de anilina anterior, se enfrió a 0-5 °C y se dejó en agitación durante 6 h. Durante este tiempo, comenzó a formarse un precipitado de PANI de color verde oscuro que indica la polimerización de la anilina en PANI. Después de la precipitación completa, el PANI se filtró y se lavó a fondo con una solución de HCl 1 M, luego con agua y etanol. Después de lavar a fondo, la suspensión se secó durante la noche a 50 °C al vacío. El polvo de PANI obtenido se molió luego en un mortero para obtener un tamaño de partícula fino.

La solución precursora para la fotopolimerización fue una mezcla de PEGDA (MW 575 Da) como polímero fotosensible, curcumina extraída de Curcuma longa como colorante absorbente de luz y bis(2,4,6-trimetilbenzoil)-fenilfosfinaóxido (también conocido como Irgacure 819) como fotoiniciador. La curcumina e Irgacure se disolvieron en la solución de proporción de volumen de PEGDA:Etanol 3:1 para obtener el sistema precursor (Tabla 1). El matraz cubierto con papel de aluminio se dejó agitar durante la noche en un ambiente oscuro. Posteriormente, se dispersó una cantidad adecuada del polvo PANI sintetizado en la solución precursora mediante sonicación y agitación magnética. Este proceso se repitió cada vez para obtener tintas fotocurables con diferentes cantidades de PANI disperso.

Se utilizó microestereolitografía de proyección (PµSL) para fabricar los andamios como se muestra en la Fig. 1. Toda la configuración de PµSL se montó en una placa de prueba óptica. Para fabricar un andamio, primero se diseñó utilizando el software AutoCAD versión 2016 para Windows (https://www.autodesk.com/products/autocad) luego de considerar parámetros de diseño óptimos como la forma, tamaño de poro, geometría, dimensiones, etc. Se exportó un archivo de estereolitografía (.stl) y se usó para cortar virtualmente la geometría 3D en proyecciones 2D usando la versión 1.3.0 del software Slic3r para Windows (https://slic3r.org/). Estas proyecciones en rodajas se usaron como impresiones digitales y también se pueden crear en el software de PowerPoint. Como fuente de luz visible se utilizó un retroproyector (Acer X1385WH) que contenía una lámpara de arco de mercurio de alta presión con un flujo luminoso de 3400 lúmenes.

Esquema de la configuración de microestereolitografía de impresión 3D personalizada. El andamio está diseñado con AutoCAD y la geometría 3D se corta virtualmente en proyecciones/impresiones 2D que actúan como fotomáscara digital. El proyector proyecta estas impresiones en un espejo que luego se reflejan en la superficie de la solución fotosensible. Solo el área iluminada de la solución se reticula a través de la reacción de fotopolimerización imprimiendo una capa sólida. La plataforma se mueve hacia abajo unas pocas micras y la solución fresca cubre esta capa impresa. Nuevamente, la solución se ilumina con otra impresión para depositar una segunda capa encima de la primera capa. De esta forma, se fabrica un andamio 3D depositando capas 2D una encima de la otra. Algunas imágenes fueron obtenidas del Servier Medical Art bajo la licencia CC-BY 3.0.

El movimiento de 3 ejes de la platina se controlaba manualmente a través de los micrómetros montados en ella y podían mover la platina una distancia mínima de 10 μm a lo largo de cada eje. Antes de iniciar el proceso de impresión, la platina se sumergió 100 μm en la solución correspondiente al espesor de cada capa impresa. Luego, desde el proyector, cada impresión se enfocó en un espejo a través de una lente convexa (longitud focal = 201,0 mm). A continuación, se reflejó sobre la superficie de la solución fotosensible en la que ya se había sumergido la platina. El área de la solución fotosensible que se iluminó con una impresión entrecruzó la solución a través de la reacción de polimerización por radicales libres, produciendo así una capa 2D. El grosor de esta capa impresa era de 100 μm correspondiente a la profundidad a la que se sumergió inicialmente la platina en la solución. Después de la deposición de la primera capa, la platina se sumergió nuevamente en la solución por 100 µm y la solución fresca cubrió esta capa impresa. Luego se iluminó con la segunda impresión depositando así la segunda capa de 100 μm de espesor encima de la primera capa. La deposición continua de capas una encima de la otra produjo un andamio 3D con un espesor controlado de cada capa. La matriz PEGDA se produjo cuando la solución se iluminó con una impresión sólida (por ejemplo, un círculo completo) contraria a las impresiones fibrosas. Esto a su vez produjo una capa sólida sin poros, a través de la misma reacción de polimerización por radicales libres descrita en la Fig. 1.

Los espectros de absorbancia de luz se obtuvieron en el rango de 300 a 800 nm utilizando un espectrofotómetro (Perkin Elmer Lambda 750). Se realizó microscopía electrónica de barrido (SEM) para analizar la morfología de los andamios. La superficie de los andamios se escaneó a diferentes voltajes (5, 10, 15 kV) y aumentos utilizando el microscopio electrónico de barrido HITACHI TM 4000. La espectroscopia infrarroja se realizó con el espectrómetro FTIR ThermoFisher Scientific™ Nicolet™ iS50 con módulo integrado ATR de cristal de diamante. La exploración se llevó a cabo entre 4000 y 500 cm−1 en el modo de absorbancia.

La conductividad a granel de los andamios se evaluó a través de dos mediciones de conductividad de sonda a temperatura ambiente con el multímetro Keithley 2700. Se colocaron andamios (unas pocas micras de espesor) entre dos sondas de acero (1,5 mm de radio) para medir su resistencia eléctrica en un modo de barrido de tiempo. La resistencia escaneada en varios puntos de tiempo se registró utilizando el software LabVIEW. La conductividad eléctrica se calculó utilizando la Ec. (1):

donde σ = Conductividad eléctrica (S/m), l = Espesor del andamio (m), r = Radio de la sonda de acero (m), R = Resistencia eléctrica promedio (Ω).

La respuesta electroquímica se evaluó usando voltamperometría cíclica (CV) en una celda estándar de tres electrodos de un compartimento usando una estación de trabajo electroquímica compacta Palm Sense. Las curvas de CV se obtuvieron en el rango de + 0,4 V a + 0,9 V a diferentes velocidades de exploración (10–18 mV/s). Se utilizaron un electrodo de calomelanos saturados (SCE) y una lámina de platino como electrodo de referencia y contraelectrodo, respectivamente. El electrodo de trabajo se realizó proporcionando un contacto de platino en la parte posterior de los andamios de investigación.

Se midió el grado de hinchamiento para evaluar el límite de hinchamiento de los andamios en condiciones fisiológicas (pH = 7,4, 37 °C). Los andamios se sumergieron en PBS 1X y se mantuvieron a 37 °C. El grado de hinchamiento se determinó midiendo la diferencia de masa entre el andamio seco y el andamio húmedo en diferentes intervalos de tiempo usando la siguiente ecuación. (2):

donde Mw = Masa del andamio húmedo en el tiempo t, Md = Masa del andamio seco.

Se controló la cinética de degradación para averiguar la tasa de degradación de diferentes andamios. Para este propósito, los andamios se sumergieron en PBS 1X a 37 °C durante 4 semanas. Después de cada semana, se calculó la cantidad de masa que perdió cada andamio midiendo la diferencia entre la masa del andamio completamente hinchado y la masa del andamio después de cada semana usando la siguiente ecuación. (3):

donde Ms = Masa del andamio completamente hinchado, Mt = Masa del andamio en el tiempo t.

Se usaron células progenitoras cardíacas de ratón (mCPC) para probar la biocompatibilidad del andamio. Las células se aislaron de los corazones de ratones C57/BI de 6 semanas de edad como se describió previamente25. Las células se cultivaron en DMEM (Gibco) que contenía FBS al 10 % (Gibco), penicilina-estreptomicina al 1 % y L-glutamina al 1 % (Sigma Aldrich). Antes de la siembra celular, los andamios se empaparon en una solución de etanol al 70 % durante 1 hora para su esterilización. Luego de esto, se secaron en una campana biológica estéril ventilada y se colocaron en una placa de 24 pocillos. Luego, los andamios se lavaron con PBS estéril y se equilibraron con DMEM que contenía FBS al 20 % durante 24 h a 37 °C para mejorar la adhesión celular.

Las células se sembraron a una densidad de 2 × 104 células/cm2 y se incubaron en DMEM que contenía FBS al 10 % a 37 °C. Las células colocadas en pozos sin andamios se consideraron como grupo de control. Después de 120 h, tanto las células adherentes como las suspendidas de cada pocillo se recogieron y se tiñeron con un ensayo de azul de tripán al 0,4 % para evaluar la viabilidad (Sigma-Aldrich, Milán, Italia). Las células vivas y muertas se contaron bajo un microscopio óptico invertido realizado por triplicado y repetido tres veces.

El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU., https://www.graphpad.com). Los datos de seis experimentos independientes se cuantificaron y analizaron para cada variable. Se utilizó la prueba t de dos colas con la misma varianza para comparar las medias, así como la prueba ANOVA de una vía. El umbral de significación estadística se fijó en P < 0,05 y se calcularon las desviaciones estándar (DE) de los valores medios para cada tipo de muestra. Los datos se presentan como media ± DE

La eficacia de la reacción de fotopolimerización depende en gran medida del equilibrio de la capacidad de absorción de luz de los componentes individuales en la solución precursora. Esta capacidad se puede describir en términos de coeficiente de absorción (α) que indica cuánta luz se absorbe por centímetro de la solución mientras viaja a través de ella. Para calcularlo, primero, los espectros de absorbancia frente a longitud de onda de los componentes se obtuvieron en concentraciones más bajas usando un espectrofotómetro como se muestra en la Fig. 2a-c. No se pudo obtener la medición directa de estos espectros en relación con la concentración real en la solución, ya que la espectroscopia UV-Visible no funciona bien con soluciones concentradas.

Los espectros de absorbancia de (a) curcumina en etanol, (b) Irgacure en acetona y (c) PANI en PEGDA a bajas concentraciones. Los recuadros muestran los valores de absorbancia a 400 nm frente a estas concentraciones de cada componente para obtener gráficos de líneas. Estos gráficos de líneas extrapolados se usaron luego para estimar los valores de absorbancia usados ​​en la síntesis real. (d) El coeficiente de absorción en el rango de longitud de onda de 300 a 800 nm de todos los componentes en relación con su concentración real en la solución final.

Después de obtener múltiples espectros de absorbancia frente a longitud de onda a bajas concentraciones, los valores de absorbancia en el límite de 400 nm se trazaron frente a las concentraciones correspondientes para obtener los gráficos lineales de absorbancia frente a concentración para todos los componentes. Este gráfico lineal también se puede obtener en cualquier longitud de onda ya que la proporción de absorción seguirá siendo la misma.

Los gráficos lineales se extrapolaron para estimar los valores de absorbancia en relación con las concentraciones reales en la solución y estos valores se sustituyeron en la ecuación. (4) para calcular el coeficiente de absorción de todos los componentes a una longitud de onda de 400 nm:

donde A = valores de absorbancia del gráfico lineal, d = longitud del camino = 0,1 cm (grosor de la cubeta).

Los coeficientes de absorción se calcularon dentro del rango de longitud de onda de 300 a 800 nm y se trazaron en la Fig. 2d, que muestra el poder de absorción relativo de la curcumina, Irgacure y PANI en la solución precursora. Este sentido de competencia entre los componentes individuales para absorber la luz nos permitió encontrar su concentración óptima en la solución final. Por ejemplo, (i) la concentración de Irgacure debe ser lo suficientemente alta como para generar radicales libres que entrecrucen la solución, (ii) la curcumina debe tener la concentración suficiente para evitar que la luz penetre profundamente en la solución, pero al mismo tiempo debe ser la menor posible. para permitir la generación de radicales libres sin absorber mucha energía luminosa, (iii) PANI tampoco debería absorber la mayor parte de la luz entrante pero debería ser suficiente para impartir conductividad eléctrica a la matriz PEGDA altamente inerte. En nuestra configuración de microestereolitografía de proyección personalizada, la reacción de fotopolimerización tuvo lugar dentro del rango de 400 a 450 nm denominado "región visible para la reacción de fotopolimerización". Más allá de este rango, Irgacure no absorbe luz para producir radicales libres para la reticulación, como se muestra en la Fig. 2 (abajo a la derecha). En general, la curcumina absorbe mucho la luz en comparación con Irgacure a la misma concentración. Por lo tanto, en la solución final, su concentración se mantuvo mucho más baja (0,016 %) en comparación con la concentración de Irgacure (1,83 %).

La orientación de las miofibras cambia en diferentes ángulos a lo largo del grosor del miocardio (Fig. 3a). Las miofibras rotan de + 70° a + 50° en la región subepicárdica, a 0° en la pared media y de − 50° a − 70° en la región subendocárdica26. Para imitar esta bioarquitectura versátil, las hebras de cada capa impresa se alinearon a lo largo de estos ángulos, como se muestra en la Fig. 3b. La deposición de estas capas 2D una encima de la otra creó un andamio 3D. La Figura 3c–f muestra las imágenes ópticas de los andamios impresos en 3D. En este estudio, la distancia entre dos hebras se expresa como "tamaño de poro" de acuerdo con la clasificación del tamaño de poro consistente con el sistema internacional de prefijos27. Los andamios de PEGDA no conductores tenían un diámetro de hebra promedio de 345 ± 6 µm, con un tamaño de poro de alrededor de 292 ± 13 µm medido con el software ImageJ. Mientras que los andamios conductores tenían un diámetro de hebra promedio de 370 ± 10 µm con un tamaño de poro promedio de 300 ± 15 µm. La distribución homogénea de la fase PANI dentro de los andamios les dio el color oscuro característico (Fig. 3g) e impartió propiedades semiconductoras a la matriz PEGDA altamente inerte. La corriente eléctrica puede fluir a través de las cadenas PANI a través del mecanismo de salto de electrones, es decir, cuando se estimulan eléctricamente, los electrones libres pueden saltar de un polarón/bipolarón (nativo del PANI dopado) a otro. Los detalles del mecanismo de conductividad se dan en otra parte28.

Estructura y morfología de los andamios impresos. (a) En el miocardio, las miofibras están orientadas en diferentes ángulos de manera jerárquica. (b) Se apilaron diferentes capas alineadas a lo largo de estos ángulos una encima de la otra para obtener un andamio 3D que imitaba esta estructura. (c) andamio PEGDA no conductor a 5X y (d) a 10X, (e) andamio conductor (0,3% PANI) a 5X y (f) a 10X. (g) Andamios con diferentes concentraciones de PANI. La figura 3A se realizó con Servier Medical Art bajo la licencia CC-BY 3.0.

La curcumina se utilizó como filtro líquido en este proceso de impresión 3D. Impidió que la luz penetrara profundamente en la solución para llegar a las capas impresas inferiores y se aseguró de que solo la parte superior de la solución recibiera suficiente energía luminosa para que tuviera lugar la reacción de fotopolimerización. En ausencia de curcumina, la luz penetraba profundamente en la solución produciendo andamios con poros cerrados y mala morfología como se muestra en la Fig. 4.

Papel de la curcumina en nuestra configuración de impresión 3D personalizada. Scaffold demostró una morfología bien definida y poros abiertos con curcumina en la solución precursora (izquierda, 5X). En ausencia de curcumina, las capas se difundieron entre sí, lo que provocó una morfología de andamiaje deficiente y poros cerrados (derecha, 5X). El color amarillo característico se puede distinguir entre los andamios debido a la curcumina que contiene (arriba a la izquierda).

Se realizó microscopía electrónica de barrido para evaluar la morfología de los andamios impresos. Como se puede ver en la Fig. 5a-c, en ausencia de PANI en la solución precursora, los andamios no conductores obtenidos tenían una geometría y un tamaño de poro bien definidos debido a la transparencia óptica de la solución. Por el contrario, la solución que contiene PANI hizo que la impresión fuera más compleja, ya que PANI también comienza a absorber la luz entrante, como se muestra en la Fig. 2 (abajo a la derecha). Esto hizo que la reacción de fotopolimerización fuera ineficiente hasta cierto punto, dependiendo de la concentración de PANI y los andamios resultantes tenían una geometría algo tosca con un tamaño de poro irregular, como se muestra en la Fig. 5d-f. Para abordar esto, la solución se expuso durante más tiempo por impresión, como se muestra en la Tabla 1. Más allá de una concentración de PANI del 2,0 %, la impresión de un andamio con características geométricas bien definidas fue todo un desafío. Puede estar asociado con el hecho de que el coeficiente de absorción (α) de PANI a estas concentraciones fue lo suficientemente alto como para prevalecer sobre la capacidad de absorción de luz de otros componentes que dificultaron la reticulación de la solución. Debido a esto, no se produjeron radicales libres a esta concentración para reticular la solución. Además, a concentraciones de PANI de 2,5 % y 3,0 %, la solución se volvió demasiado viscosa para trabajar con ella. Incluso después de una exposición de más de 20 s por impresión, nunca se logró un andamio bien definido con la morfología y el tamaño de poro adecuados. Solo se obtuvo un disco sólido a estas concentraciones que se caracterizó aún más mediante microscopía electrónica como se muestra en la Fig. 5g-h y otras técnicas.

Morfología de los andamios impresos. (a) Matriz de PEGDA sin PANI, (b) Estructura de PEGDA no conductora a 60X y (c) a 150X, (d) 2 % de PANI integrado en la matriz de PEGDA, (e) Estructura conductora con 2 % de PANI a 50X y (f) a 100X, (g) la morfología arrugada indica la distribución homogénea del 3% de PANI en la matriz PEGDA a 100X, y (h) a 200X de aumento.

La morfología jerárquica del andamio también se evaluó mediante un análisis SEM más profundo. La figura 6a-c corresponde a andamios PEGDA sin PANI, mientras que en la figura 6d-f el andamio PEGDA-PANI tiene PANI al 2,0 %. Puede verse que los hilos giran en diferentes ángulos indicados por el círculo en la Fig. 6a. Una imagen más ampliada (Fig. 6b) muestra la rotación de varios hilos profundamente en el andamio indicado por números que corresponden a los números de capa en la Fig. 3b. La vista de la sección transversal de los andamios se puede ver en la Fig. 6c,f en la que las hebras se desplazan hacia el plano del papel. Puede verse en estas Figuras que los hilos fueron depositados unos encima de otros mientras se alineaban en diferentes ángulos confirmando la morfología jerárquica de los andamios. La concentración máxima de PANI a la que fue posible imprimir con nuestra impresora PμSL hecha a medida fue del 2,0 %. Es por eso que se pueden ver muchas partículas PANI en la Fig. 6f al igual que estas partículas se pueden ver incrustadas en la matriz PEGDA en la Fig. 5d. Contrariamente a esto, el andamio sin PANI tenía una morfología bien definida como se muestra en las Fig. 6c, 5b y 5c.

Morfología jerárquica de los andamios impresos. (a) andamio de PEGDA a 44X mientras que el círculo indica la rotación de los hilos profundamente en el andamio, y (b) andamio de PEGDA a 133X mientras que los números indican la capa 1 en la parte superior y las capas subsiguientes en lo profundo del andamio girando en ciertos ángulos, (c) cruce -sección del andamio en 107X, (d) PEGDA con 2.0% PANI en 44X, y (e) en 133X, (f) sección transversal en 67X que representa varias capas depositadas una encima de la otra durante la impresión 3D.

PANI existe en tres estados redox: leucoemeraldina totalmente reducida, esmeraldina parcialmente oxidada y pernigranilina totalmente oxidada29. Estas estructuras pueden estar protonadas o desprotonadas, ya sea en un medio ácido o básico, respectivamente. Sin protonación, estas formas se denominan "base", como la base esmeraldina. Después de la protonación, se denominan "sal", como la sal de esmeralda. La sal de esmeraldina es la única forma electroconductora de PANI. La espectroscopia infrarroja proporcionó información sobre los estados de oxidación de las cadenas PANI. El análisis del espectro vibracional señaló la forma esmeraldina protonada de PANI lograda durante el proceso de síntesis (Fig. 7).

Espectro FTIR-ATR de forma conductora (sal de esmeralda) de PANI (azul), PANI incrustado en PEGDA (rojo) y PEGDA (negro).

En particular, en los espectros del compuesto PANI y PEGDA-PANI (línea azul y roja, respectivamente), podemos observar los picos en 809 y 1569 cm−1, que representan el modo de vibración de flexión C-H del anillo de benceno y el C =C estiramiento del anillo quinoide30,31. Mientras que el pico a 1226 cm-1 en el espectro PANI, desplazado a 1190 cm-1 en PEGDA-PANI puede atribuirse al modo de estiramiento C-N en el grupo bencenoide32. Estas señales distintivas confirman la síntesis exitosa del PANI en la forma conductora, es decir, la sal de esmeraldina. Los picos característicos de PEGDA se pueden encontrar en 1095, 1723 y 2868 cm-1 en los espectros de PEGDA y PEGDA-PANI (línea negra y roja, respectivamente). Estas señales se pueden atribuir respectivamente a la vibración de estiramiento de –C–O–C–, –CH y –C=O de la columna vertebral de PEGDA33.

La técnica de dos sondas se utilizó para medir la conductividad eléctrica a granel de los andamios impresos. La Tabla 2 informa los valores obtenidos para los andamios de PEGDA-PANI en comparación con los del tejido miocárdico murino y el andamio de PEGDA inerte. Cabe señalar que PEGDA se caracteriza por una conductividad en el rango de 10–9 S/m típico de los aisladores de plástico. Sin embargo, la introducción de PANI en este andamio inerte aumentó la conductividad en 103 veces hasta ~ 10–6 S/m, impartiendo así un comportamiento semiconductor. Este valor es comparable a los obtenidos para materiales PEGDA-PANI con la misma cantidad de relleno34. La mejora en las propiedades conductoras sigue al aumento de la concentración de PANI, lo que indica que se logró una transferencia de carga más eficiente entre las cadenas de PANI mediante la formación de una red conductora homogénea dentro de la matriz PEGDA. No se detectó ninguna respuesta eléctrica por debajo del 0,9 % de contenido de PANI. Esto podría deberse a la falta de redes conductoras a granel entre las cadenas de polímeros.

Se realizaron mediciones de voltamperometría cíclica (CV) para probar la actividad electroquímica de los andamios producidos. El análisis se llevó a cabo en una solución de HCl 0,1 M y los datos se adquirieron a diferentes velocidades de exploración. Es evidente a partir de la Fig. 8 que las curvas de CV muestran picos anódicos (Ea) y catódicos (Ec) anchos en torno a +0,74 V y +0,66 V, respectivamente. Este par redox puede estar relacionado con la transición de la forma semioxidada de esmeraldina PANI a la forma completamente oxidada de pernigranilina y viceversa36,37. La presencia de tal característica electroquímica indica la reversibilidad química de los procesos redox. Además, se observó un aumento en la densidad de corriente con el aumento de las concentraciones de PANI en la matriz PEGDA de acuerdo con lo encontrado para el comportamiento eléctrico. Es interesante notar que los andamios con 0,3% y 0,6% PANI son capaces de responder a la estimulación eléctrica mientras realizan el CV, mientras que no es posible medir sus valores de conductividad a través del método de dos sondas. Estos resultados podrían aclararse considerando que los procesos electroquímicos no solo involucran transferencia de electrones sino también difusión iónica entre el polímero y la solución electrolítica.

Voltamogramas cíclicos de andamios conductores a diferentes velocidades de exploración de (a) 0,3 % PANI, (b) 0,6 % PANI, (c) 0,9 % PANI y (d) 1,5 % PANI.

Como se puede observar en la Fig. 8, se encontró un aumento en la densidad de corriente con una velocidad de barrido que va de 10 a 80 mV/s. Mientras que los picos anódicos (EA) conservan su posición, los catódicos (EC) se desplazan ligeramente a un potencial más bajo. Esta característica puede estar asociada con la irreversibilidad electroquímica parcial de la reducción de la cadena, probablemente debido a una cinética compleja del proceso. También podría deberse a algunas modificaciones químicas/estructurales que acompañan a la transferencia de electrones22. En resumen, el análisis de las investigaciones electroquímicas destacó la electroactividad y la capacidad de la inclusión de PANI para modular la concentración iónica en la matriz de hidrogel PEGDA. De esta manera, esta característica se puede explotar de manera eficiente en varios campos biomédicos para producir dispositivos/andamios que imiten la naturaleza eléctrica de los sistemas biológicos.

El grado de hinchamiento se midió sumergiendo los andamios en PBS 1X a 37 °C durante 24 h. Como se muestra en la Fig. 9, el grado máximo de hinchamiento de los andamios (≤ 60 %) no es pronunciado en comparación con los hidrogeles típicos que suelen mostrar comportamientos de hinchamiento abruptos. Las células cultivadas expuestas a entornos que se expanden abruptamente a menudo pueden desencadenar apoptosis debido a las altas tensiones generadas en la red de hidrogel en expansión38. En nuestro caso, todos los andamios demostraron un comportamiento de hinchazón algo constante y alcanzaron su límite dentro de los 30 minutos de inmersión en el PBS. La presencia de PANI dentro de la matriz de PEGDA disminuyó el grado de hinchazón independientemente de su concentración. Esto puede deberse a una probable mayor rigidez del material compuesto con respecto a un andamio de hidrogel PEGDA puro.

Grado de hinchamiento de andamios impresos en 3D con diferentes concentraciones de PANI.

La degradación de los andamios impresos se investigó sumergiendo los andamios en 1X PBS a 37 °C durante 4 semanas, ya que es bien sabido que los enlaces éster (–O–C=O), generalmente formados durante el entrecruzamiento radical de los hidrogeles PEGDA, son propenso a reacciones de hidrólisis39.

Como podemos ver en la Fig. 10, para bajas concentraciones no existe una correlación significativa entre el proceso de degradación y la presencia de PANI dentro de la matriz PEGDA dentro del error experimental. Se registra una degradación más consistente con una inclusión de PANI del 2 %, alcanzando una pérdida de masa del 15 % después de cuatro semanas. Esto puede estar asociado con una menor reticulación de PEGDA razonablemente inducida por la mayor presencia de PANI en esa muestra.

Perfil de degradación hidrolítica de andamios impresos en 3D con diferentes concentraciones de PANI.

La viabilidad de las células progenitoras cardíacas de ratón (mCPC) se evaluó mediante el ensayo Trypan Blue después de 5 días de incubación, como se muestra en la Fig. 11. El grupo de control para este experimento fue la suspensión celular colocada en diferentes pocillos de una placa de 24 pocillos sin andamio en los pozos. Los resultados demostraron que los andamios no indujeron efectos citotóxicos profundos que impidieran el crecimiento celular en relación con el grupo de control. De hecho, todos los andamios demostraron una buena biocompatibilidad y la viabilidad no fue muy diferente en comparación con el grupo de control. Sin embargo, la naturaleza eléctrica de los andamios conductores parecía estar mejorando la viabilidad en comparación con los andamios no conductores, aunque los resultados no fueron estadísticamente significativos ya que la viabilidad media de todos los grupos parece ser la misma (P = 0,23 entre grupos, unidireccional). ANOVA). Los andamios conductivos pueden haber conducido a una mejor comunicación intercelular mejorando así la viabilidad relativa debido a su naturaleza eléctrica, característica de los andamios conductivos observados en estudios previos40,41,42. Esto también podría ser una razón para la existencia de significación estadística (a través de la prueba t) entre el control y los andamios de PANI de alta concentración, mientras que los andamios de baja concentración de PANI o PEGDA puro no dieron como resultado una significación estadística debido a la ausencia de comunicación intercelular. Estas observaciones muestran que los andamios de PEGDA-PANI podrían ser una mejor alternativa a los andamios no conductores tradicionales cuando se trata de regenerar tejidos altamente conductores.

Viabilidad de las células progenitoras cardíacas de ratón (mCPC) en los andamios impresos (n = 6). A la izquierda, las micrografías representativas muestran mCPC teñidas con (A) DAPI (núcleos en azul), (B) actina F (rojo) y (C) su fusión. Arriba a la derecha, la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo Trypan Blue después de 5 días de cultivo. Las barras representan la viabilidad de las células en relación con el porcentaje del control. Los datos se representan en Media ± DE de los experimentos por triplicado. Se realizó una prueba t de dos colas con la misma varianza para averiguar la significancia estadística (*P < 0,05) entre el grupo de control (suspensión celular) y los otros grupos (suspensión celular + andamio), mientras que el ANOVA de una vía entre los grupos resultó estadísticamente insignificante. resultados (P = 0,23) que muestran que la viabilidad media fue la misma entre todos los grupos como se puede observar por los valores indicados en el gráfico de barras.

El santo grial de la ingeniería de tejidos siempre ha sido imitar exactamente las características del tejido que se pretende diseñar. Estas características incluyen, entre otras, bioarquitectura tisular, elasticidad/rigidez, biodegradabilidad y biocompatibilidad. El andamio juega un papel importante en este esfuerzo, una estructura polimérica diseñada para apoyar el crecimiento y la diferenciación celular, al tiempo que emula la estructura y función de la MEC. Se ha logrado un progreso significativo en el diseño de andamios cuando se diseñaron órganos relativamente simples, como vasos sanguíneos, piel, vejiga y cartílago43,44,45,46,47. El miocardio, en cambio, es muy difícil de diseñar debido a su anisotropía 3D, sus desconcertantes propiedades biomecánicas y su complicada bioarquitectura micro/nano.

Hasta el momento, los andamios cardíacos se han fabricado utilizando materiales biológicamente inertes para ser un mero soporte para el crecimiento celular. En cambio, la ECM miocárdica, que es el andamio natural del miocardio, es un material de andamiaje producido por los fibroblastos y hecho de una sustancia gelatinosa (matriz) y fibras de diferentes longitudes y rigidez, y puede abordar el destino celular. Los fibroblastos inactivos se distribuyen dinámicamente dentro del miocardio, mientras que los trastornos patológicos desencadenan su activación en los miofibroblastos, alterando la composición y acumulación de la MEC y, por lo tanto, la función miocárdica48. La MEC emite señales biológicas (factores de crecimiento, citocinas, hormonas, etc.) y físicas (como factores mecanoestructurales, rigidez, nano rugosidad, microporosidad, etc.) que concurren a modular el destino de las células cardíacas. Además de las señales biológicas, hasta ahora se ha prestado especial atención a descifrar cómo las células traducen los estímulos mecánicos en señales intracelulares, mientras que solo unos pocos estudios se han centrado en el mecanismo celular que detecta las señales eléctricas (electrodetección).

Varios estudios demostraron que los materiales bioinstructivos, dotados de señales bioeléctricas y topográficas, representan un enfoque prometedor para regenerar tejidos altamente anisotrópicos como el músculo esquelético. En 49, se encontró que la alineación de nanofibras y la concentración de PANI en andamios de policaprolactona electrohilados inducen la formación de miotubos en mioblastos, lo que confirma los efectos sinérgicos de las señales eléctricas y topográficas. Sin embargo, los mecanismos profundos a través de los cuales los materiales electroconductores instruyen a las células aún no se conocen. Otros estudios50,51,52,53,54 han demostrado la eficacia de los andamios electroconductores, pero hasta el momento no se han publicado pruebas concluyentes sobre el papel de su conductividad eléctrica. De hecho, las señales eléctricas más débiles que el potencial de acción se detectaron extracelularmente utilizando la tecnología de matriz de electrodos múltiples55,56,57,58,59 pero, muy probablemente, su acción por sí sola no es suficiente para determinar el destino celular. Los efectos beneficiosos de las construcciones electroconductoras también se observaron cuando se implantaron en el sitio de la lesión en modelos MI de rata60,61,62,63. Sin embargo, estos estudios se orientaron mayoritariamente a repetir las características del miocardio maduro para llenar el vacío de conductividad creado por las cicatrices post-infarto, donde lo racional era solo recrear una guía para el impulso eléctrico que preside la contracción miocárdica. Una idea innovadora podría ser desarrollar un sistema para identificar y caracterizar microcorrientes que potencialmente no estén involucradas en la contracción, pero que sean relevantes (junto con otras señales físicas y biológicas) en la comunicación célula-célula para determinar el destino celular. En este contexto, propusimos un estudio técnico preliminar para desarrollar andamios electroconductores para investigar la electrodetección de células cardíacas inmaduras. La optimización del proceso de microestereolitografía de alta resolución nos ha llevado a obtener sistemas PEGDA-PANI electroconductores impresos en 3D. Diferentes concentraciones de PANI permiten modular la electroactividad y la electroconductividad de manera que las señales eléctricas y mecanoespaciales puedan sintonizarse recíprocamente para proporcionar estímulos a las células inmaduras. Estos logros son destacados para determinar el destino celular y mantener su fenotipo final. En este sentido, las pruebas de viabilidad celular realizadas demuestran que los materiales PEGDA-PANI no inducen efectos citotóxicos severos y confirman su validez como andamios para una comprensión más profunda de las señales biológicas y físicas que gobiernan el desarrollo celular.

La microestereolitografía de proyección demostró ser una herramienta útil para imitar la bioarquitectura estriada del tejido cardíaco. Los andamios, aunque semiconductores, han demostrado su eficacia biológica cuando se cultivan con células progenitoras cardíacas de ratón. Muestra que dentro del marco de referencia de las células madre cardíacas inmaduras, los andamios semiconductores pueden mejorar la comunicación intercelular y la sincronización de las células inmaduras/en desarrollo.

De hecho, el desarrollo de andamios tan eléctricamente conductores como el miocardio (0,16 S/m) es muy deseable para fabricar tejidos cardíacos modificados y, finalmente, para restaurar las funciones eléctricas perdidas del corazón lesionado. Sin embargo, todavía es un desafío desarrollar tales construcciones utilizando la tecnología actual. Por lo tanto, se puede concluir que los andamios eléctricamente conductores podrían proporcionar mejores plataformas cuando se trata de diseñar tejidos biológicos altamente conductores en comparación con los andamios no conductores. Sin embargo, se deben encontrar nuevas alternativas a los polímeros conductores que serían biodegradables y pueden demostrar altas propiedades eléctricas para empujar los andamios conductores actuales de ser semiconductores a buenos/altos conductores.

Los autores declaran que los conjuntos de datos relevantes que respaldan este estudio se proporcionan en este artículo. Sin embargo, los conjuntos de datos sin procesar que respaldan varios hallazgos se pueden solicitar al autor correspondiente.

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Arsalan Ul Haq, Francesca Pescosolido, Felicia Carotenuto, Fabio De Matteis, Emanuela Tamburri & Paolo Di Nardo

Departamento de Ciencias y Tecnologías Químicas, Universidad de Roma "Tor Vergata", Via Della Ricerca Scientifica, 00133, Roma, Italia

Luca Montaina, Francesca Pescosolido & Emanuela Tamburri

Departamento de Ingeniería Empresarial "Mario Lucertini", Universidad de Roma "Tor Vergata", Via del Politecnico 1, 00133, Roma, Italia

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Departamento de Ingeniería Industrial, Universidad de Roma "Tor Vergata", Via del Politecnico 1, 00133, Roma, Italia

Fabio de Matteis

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Correspondencia a Paolo DiNardo.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Ul Haq, A., Montaina, L., Pescosolido, F. et al. Andamios eléctricamente conductores que imitan la estructura jerárquica de las miofibras cardíacas. Informe científico 13, 2863 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29780-w

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Recibido: 06 Octubre 2022

Aceptado: 10 febrero 2023

Publicado: 17 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29780-w

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