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Apr 28, 2023

Regeneración mejorada del tejido óseo usando un 3D

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 3139 (2023) Citar este artículo

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Las propiedades mecánicas y biológicas del ácido poliláctico (PLA) deben mejorarse aún más para poder utilizarlo en la ingeniería de tejido óseo (BTE). Utilizando una técnica de extrusión de materiales, se fabricaron con éxito andamios tridimensionales (3D) PLA-Ti6Al4V (Ti64) con poros abiertos y canales interconectados. A pesar de que la temperatura de transición vítrea del PLA aumentó con la adición de Ti64, las temperaturas de fusión y cristalización, así como la estabilidad térmica de los filamentos, disminuyeron ligeramente. Sin embargo, la adición de 3 a 6 % en peso de Ti64 mejoró las propiedades mecánicas del PLA, aumentando la resistencia máxima a la compresión y el módulo de compresión del PLA-3Ti64 a 49,9 MPa y 1,9 GPa, respectivamente. Además, las evaluaciones de fluidez revelaron que todos los filamentos compuestos cumplían con los requisitos de impresión. Durante el tratamiento con plasma de los andamios, no solo aumentó la raíz cuadrada media (Rq) de PLA (1,8 nm) a 60 nm, sino que también disminuyó significativamente su ángulo de contacto (90,4°) a (46,9°). El análisis FTIR confirmó la mayor hidrofilicidad a medida que los grupos que contenían oxígeno se volvieron más intensos. En virtud del destacado papel del tratamiento con plasma, así como de la adición de Ti64, se observó una marcada mejora en la unión, proliferación (tinción con 4′,6-diamidino-2-fenilindol) y diferenciación (fosfatasa alcalina y alizarina) de células madre mesenquimales de la gelatina de Wharton. tinción roja S). Según estos resultados, parece que los andamios fabricados tienen aplicaciones potenciales en BTE.

Los huesos humanos han sido propensos a enfermedades graves y defectos como traumatismos, osteoporosis y cáncer1. Para curar estas enfermedades ha sido habitual implantar en el cuerpo sustancias metálicas no biodegradables, generalmente a base de titanio y acero inoxidable2. Sin embargo, este abordaje provocó cirugías secundarias para extraer el metal del cuerpo, derrochando tiempo y materiales3. El uso de sustitutos óseos ha atraído recientemente la atención de muchos expertos para reparar huesos dañados sin enfrentar los desastres asociados con los métodos convencionales4. Esto se debe principalmente a que estos materiales biodegradables son sitios preferibles para que varios tipos de células crezcan y regeneren tejido óseo nuevo5. Sin embargo, es crucial mencionar que el tipo de sustituto juega el papel más influyente, ya que se requiere que muestre características similares al hueso inicial. Estas características vitales incluyen una adecuada estabilidad mecánica, asegurando la adherencia, proliferación y diferenciación de las células responsables de la regeneración ósea6. La mayoría de los sustitutos óseos fabricados se han basado en metales y cerámicas biocompatibles, lo que indica una resistencia suficiente7. Sin embargo, algunos inconvenientes limitan el uso de estas sustancias en aplicaciones de base biológica. Uno de los principales problemas es que el módulo de la mayoría de las cerámicas y metales es significativamente mayor que el de los huesos, lo que desequilibra la transferencia de carga y provoca la reabsorción ósea como consecuencia del efecto de protección contra el estrés8,9. Además, varios defectos en las cerámicas disminuyen su capacidad para demostrar una tenacidad aceptable. Además, alrededor de los implantes metálicos, aparecen algunos artefactos durante la resonancia magnética (RM) y la tomografía computarizada (TC), lo que invalida la precisión de los resultados10. Por lo tanto, encontrar un candidato a biomaterial prometedor sigue siendo un gran desafío para los investigadores.

Actualmente, los polímeros biocompatibles, como la polieteretercetona (PEEK), la policaprolactona (PCL) y el ácido poliláctico (PLA), muestran un alto potencial para su uso en ingeniería de tejido óseo (BTE), gracias a su biodegradabilidad, no toxicidad, no inmunogénico y propiedades no inflamatorias 11. Entre una amplia gama de compuestos poliméricos, el PLA, un poliéster alifático termoplástico, se ha presentado como uno de los mejores candidatos en la ingeniería de tejidos duros. Este polímero rentable posee una temperatura de fusión baja y una biocompatibilidad aceptable, lo que allana el camino para su uso en BTE12. A pesar de las ventajas del PLA, la baja actividad biológica y las propiedades mecánicas se consideran deméritos que deben abordarse13.

Se han realizado varios intentos para mejorar el rendimiento de los andamios de PLA mediante la adición de refuerzos externos. PCL, por ejemplo, ha demostrado ser uno de los polímeros más utilizados debido a su biocompatibilidad y comparabilidad con la tasa de regeneración ósea. Sin embargo, los compuestos PLA/PCL también pueden tener propiedades mecánicas inferiores, como un módulo o una resistencia bajos14. En otro estudio, cuando se incrustó β-fosfato tricálcico (β-TCP) en el PLA como un relleno cerámico rígido, la tenacidad y la ductilidad disminuyeron, lo que se atribuyó a la distribución no uniforme de las partículas15. Si bien las cerámicas y los polímeros no pudieron mejorar las propiedades mecánicas del PLA, los rellenos metálicos se propusieron como alternativas efectivas debido a sus fascinantes características biocompatibles y de dureza. Por ejemplo, uno de los estudios recientes indicó que la resistencia a la compresión de la matriz PLA mejoró en un 8,3 % al incorporar un 5 % en peso de polvos de magnesio16.

Se han empleado varios métodos de fabricación en la última década para fabricar andamios de biocompuestos, incluido el moldeado, la formación de espuma con gas, la colada con disolventes, la extrusión, la polimerización y el electrohilado17,18. Sin embargo, en la mayoría de los casos, estos enfoques no lograron mostrar un rendimiento mecánico y biológico aceptable debido al impacto negativo de la toxicidad del solvente o de las partículas residuales19. En los últimos años, la impresión 3D se ha introducido como un método eficaz para preparar andamios porosos complejos para la ingeniería de tejidos mediante el control de la geometría interna y las estructuras de los poros20,21. Entre los diferentes tipos de enfoques de impresión 3D, las muestras poliméricas se preparan principalmente mediante técnicas de modelado por deposición fundida (FDM) y sinterización selectiva por láser (SLS)22,23. FDM ofrece una mayor flexibilidad en el manejo de materiales y una mejor rentabilidad en la producción de estructuras porosas sin emplear solventes como con la estereolitografía (SLA) y SLS24,25. Este llamativo proceso implica la extrusión de un filamento de alimentación a base de termoplástico desde una boquilla calentada junto con la solidificación de las perlas de filamento en la cama de impresión, lo cual es deseable para fabricar andamios compuestos26.

Aunque se han realizado algunos estudios para fabricar y examinar andamios impresos compuestos de polímero/metal y han arrojado resultados prometedores, todavía quedan algunos problemas. Como ejemplo, se fabricaron andamios de PLA/Titanio27 y PLA/hierro puro28 impresos en 3D utilizando la técnica FDM; sin embargo, aunque estos estudios lograron resultados útiles, no demostraron que se pueda fabricar filamento de alta calidad (con un diámetro constante, suficiente dispersión de partículas y una porosidad insignificante) utilizando esta tecnología. En otra investigación29, los andamios de PLA/Zinc impresos en 3D se imprimieron utilizando tecnología FDM; sin embargo, no se llevó a cabo ningún análisis biológico y los andamios no mostraron ninguna mejora en las propiedades mecánicas. Además, Cifuentes et al.16 y Jiang et al.30 produjeron andamios de acero inoxidable PLLA/Magnesio y PLA/316L impresos en 3D, respectivamente, pero no incluyeron ninguna evidencia con respecto a la evaluación reológica y biológica.

La aleación Ti6Al4V (Ti64), como la aleación metálica más utilizada en la fabricación aditiva de implantes ortopédicos31, ofrece una serie de ventajas, entre ellas una excelente biocompatibilidad en contacto con hueso y tejidos, una alta probabilidad de promover la maduración osteoblástica, como osteogénico El medio ambiente se establece cuando se cultivan células similares a los osteoblastos sobre su sustrato, lo que podría mejorar la formación ósea32. A pesar de esto, las técnicas de fabricación aditiva más comunes para fabricar implantes de Ti64 son SLS, fusión selectiva por láser (SLM) y fusión por haz de electrones (EBM)33. Se han realizado numerosos estudios sobre el desarrollo y la mejora de los implantes ortopédicos Ti64 como implantes totalmente metálicos para que puedan cumplir los requisitos de los implantes óseos34,35,36,37,38. Sin embargo, hasta donde sabemos, Ti64 aún no se ha investigado para su uso como aditivo metálico en técnicas de fabricación aditiva de extrusión de materiales (MEAM), como FDM y SLA, todas las cuales se utilizan para fabricar andamios compuestos a base de polímeros.

Aunque los andamios impresos en 3D proporcionan muchos lugares para que las células se adhieran, sus propiedades se pueden mejorar aún más con algunos tratamientos posteriores39. Según trabajos previos, la biocompatibilidad de los materiales ortopédicos, la adhesión celular, la proliferación y la diferenciación de las células se pueden mejorar utilizando un amplio espectro de métodos de modificación de la superficie, como la biofuncionalización, el recubrimiento y el tratamiento con plasma no térmico40,41. En comparación con los procesos mencionados anteriormente, se ha informado que el tratamiento con plasma produce nanorrugosidad en la superficie del andamio, cambia la humectabilidad y modifica la superficie con grupos funcionales como átomos de oxígeno (es decir, especies reactivas de oxígeno (ROS)) con menor fabricación. costos y complejidad42. Por ejemplo, después del tratamiento con plasma del armazón PCL/HA/MgO con O2 y N2, la morfología de la superficie física y las propiedades químicas de la superficie del armazón 3D aumentaron la adhesión, proliferación y diferenciación de las células MC3T3-E1 en el PCL/HA/ Andamios de MgO43.

En consecuencia, este estudio se llevó a cabo para investigar la capacidad de Ti6Al4V (Ti64) como agente de refuerzo metálico PLA alternativo. Al utilizar la impresión 3D basada en FDM, se construyeron e investigaron andamios 3D de PLA-Ti64 con diversos contenidos de Ti64 (0, 3, 6 y 9% en peso) desde el punto de vista mecánico, físico, térmico, de fluidez, biológico. y características microestructurales. Como parte del estudio, se eligió una concentración optimizada de Ti64 en función de las propiedades mecánicas y un ensayo de viabilidad celular. Posteriormente, el andamio PLA-Ti64 seleccionado se trató con oxígeno y plasma de aire para determinar cómo afecta el tratamiento con plasma a las propiedades físicas y biológicas de los andamios. Para hacerlo, se evaluó la adhesión, proliferación y diferenciación de las células madre mesenquimales de la gelatina de Wharton en los andamios tratados con plasma. La figura 1 muestra una ilustración esquemática de los pasos de preparación y caracterización del andamio compuesto poroso PLA/Ti64 en 3D.

Ilustración esquemática del método utilizado para fabricar andamios compuestos de PLA/Ti64 porosos en 3D.

Ha sido un gran desafío fabricar biocompuestos en los que los refuerzos se distribuyen uniformemente a través de la matriz. De acuerdo con trabajos previos, para superar este problema, se debe seleccionar la cantidad optimizada de relleno44. Por lo tanto, en el primer paso, se estudió el efecto de diferentes concentraciones de Ti64 (0, 3, 6, 9% en peso) sobre la morfología de la superficie de los filamentos de PLA mediante un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo (FESEM). Como se ve en la Fig. 2a–d, cuando aumentó la cantidad de relleno, la superficie se volvió relativamente más áspera y se encontraron más rayones. Por un lado, esta rugosidad se puede atribuir a las micropartículas de Ti64 distribuidas en la superficie del filamento. Por otro lado, una fuerza de fricción que se aplica al compuesto fundido durante el proceso de extrusión induce a los rellenos a dejar colas en forma de líneas irregulares en la superficie del PLA30. Además, según la Fig. 2e-h, que indica vistas transversales perpendiculares al eje del filamento, aunque la distribución de las partículas blancas de Ti64 se encontró homogénea en PLA-3% en peso de Ti64 (PLA-3Ti64) y PLA-6 En las muestras de %Ti64 en peso (PLA-6Ti64), surgieron algunas aglomeraciones en el filamento PLA-9 %Ti64 en peso (PLA-9Ti64), lo que corresponde a la formación de microhuecos en PLA45. Estas partículas aglomeradas jugaron un papel destructivo como fuertes barreras contra el flujo de PLA y dificultaron la condensación de la matriz46. La Figura 2i–l compara las imágenes FESEM y ópticas de muestras impresas en 3D de PLA puro y PLA-6Ti64. Aparentemente, la ausencia de defectos como microfisuras, delaminación y huecos en los puntales de los andamios demuestra la alta calidad de las muestras impresas. Para determinar qué tan precisos eran los andamios impresos en 3D en términos de sus dimensiones, se midió el tamaño de los poros y puntales. Con base en el análisis estadístico, no hubo cambios notables en el tamaño de poro, la porosidad y el ancho del puntal de las muestras, registrados en 270 µm, 35 % y 380 µm, respectivamente, que fueron ligeramente más pequeños que los valores ajustados (300 µm , 40% y 400 µm). Estas ligeras diferencias surgen de la contracción del volumen durante el proceso de impresión debido al gradiente térmico negativo desde la boquilla hasta la cama de impresión47. Estos poros abiertos y canales interconectados juegan un papel destacado al proporcionar a las células sitios más activos para infiltrarse y crecer y facilitar el transporte de nutrientes, oxígeno y desechos metabólicos48.

Imágenes FESEM que muestran la morfología de la superficie (ad) y las vistas transversales (e-h) de PLA puro (a, e) y filamentos compuestos que contienen 3 % en peso (b, f), 6 % en peso (c, g), y 9% en peso (d, h) Ti64. Las flechas azul y amarilla en (h) están relacionadas con microhuecos y aglomeraciones, respectivamente. FESEM con un modo secundario (i, j) e imágenes estereomicroscópicas (k, l) de andamios impresos en 3D PLA puro (i, k) y PLA-6Ti64 (j, l).

Vale la pena mencionar que no solo están presentes los picos de Ti, Al, V, C y O en el análisis de espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDX) presentado en la Fig. S1, que están relacionados con las contrapartes de Ti64 y PLA, pero también el la ausencia de iones de cloruro en los filamentos podría ser un signo positivo de que el material peligroso se ha eliminado por completo del filamento compuesto durante el proceso de fabricación.

Las propiedades térmicas del PLA se evaluaron mediante análisis de calorimetría de barrido diferencial (DSC) para determinar el impacto del contenido de Ti64. La temperatura vítrea (Tg) es un parámetro importante que indica la movilidad de la cadena de polímeros con respecto a la temperatura49. Se ha informado que el valor de Tg depende en gran medida del tipo de refuerzo. Por ejemplo, mientras que la estructura de núcleo-envoltura de hidroxiapatita/plata (HA@Ag) podría aumentar la temperatura vítrea del PLA, las partículas de Fe3O4 exhibieron una tendencia inversa con el aumento del contenido de relleno50,51. En nuestro estudio, similar a la estructura HA@Ag/PLA, cuando se cargaron más partículas de Ti64 en la matriz de PLA puro, la Tg de PLA (57 °C) experimentó una tendencia ascendente y alcanzó 59,8 °C, 61,6 °C y 62,7 °C, para compuestos que contienen 3, 6 y 9 % en peso de Ti64, respectivamente (Fig. 3a y Tabla 1). Un ligero aumento en la Tg se puede atribuir al papel de interferencia de las partículas de Ti64, que dificultan la movilidad de la cadena y la lubricación de PLA52. Sin embargo, a diferencia de los cambios en Tg, al aumentar la concentración de Ti64, la temperatura de cristalización en frío (Tc) disminuyó gradualmente de 97 (PLA puro) a 89,4 °C (PLA-9Ti64). Cuantas más partículas de Ti64, más sitios de nucleación, proporcionando los lugares preferibles para que cristalice el PLA, lo que resulta en una disminución de la temperatura de cristalización en frío27. Otro parámetro crítico que está influenciado por la concentración de Ti64 es la capacidad de cristalización de PLA (Xc). Mientras que el valor de Xc aumentó con la adición de Ti64 y alcanzó la cifra máxima de (8,7 %) para la muestra PLA-6Ti64, la tendencia se invirtió y Xc cayó al 4,5 % para el filamento PLA-9Ti64. La primera observación probablemente se atribuya a las partículas de Ti64 dispersas como agentes de nucleación, que allanaron el camino para la cristalización de PLA a través de la nucleación heterogénea. Sin embargo, la caída probablemente esté relacionada con las partículas aglomeradas de Ti64 consideradas como centros de tensión de concentración, restringiendo la movilidad de las cadenas de PLA y la cristalización53. Además, al aumentar la cantidad de contenido de Ti64, el punto de fusión del PLA exhibió la misma tendencia decreciente que la Tc. Las partículas de Ti64 con el mismo papel en la cristalización pueden actuar como sitios de nucleación, acelerando la fusión de cristales preformados a temperaturas más bajas durante el calentamiento54.

Curvas DSC de filamento PLA puro y filamentos compuestos con varios contenidos de Ti64 (a). Resultados XRD de muestras impresas en 3D (b).

También se llevó a cabo un análisis de difracción de rayos X (XRD) para investigar la composición química y la cristalización de fase de diferentes compuestos PLA-Ti64 impresos en 3D. Como se ilustra en la Fig. 3b, un pico ancho en PLA puro, ubicado en el ángulo de difracción de 16°, demuestra la formación de la fase amorfa del polímero55. A medida que aumentaba la concentración de Ti64, no solo los picos principales agudos a 35°, 38° y 40°, que están relacionados con los planos {100}, {002} y {101} de Ti64, se volvieron más intensos, pero también el pico del cristal PLA se hizo más estrecho y más nítido50. Es posible explicar la primera observación por el hecho de que la intensidad máxima de Ti64 conduce directamente a un aumento en la concentración de Ti64. El segundo, sin embargo, proviene de la mejora de la cristalinidad del PLA de acuerdo con los resultados de DSC.

La estabilidad térmica es una propiedad vital que manifiesta la capacidad de impresión de las muestras. Es obvio que los niveles altos o bajos de degradación de la temperatura afectan negativamente a la calidad de las muestras impresas en 3D56. Para terminar con esto, es crucial ajustar el valor de este parámetro en el rango aceptable por encima y cerca de la temperatura de la ventana. Para investigar la estabilidad térmica de los filamentos, los cambios en la pérdida de peso en función de la temperatura se trazaron en la Fig. 4a-c. Para ello se introducen diferentes temperaturas, entre ellas la temperatura de inicio de degradación (T0), la temperatura de pérdida del 15% de peso (T15), la temperatura de pérdida del 50% de peso (T50) y la temperatura de finalización de la descomposición (Te). marcado. Primero, solo se observó un paso de descomposición térmica en el intervalo de temperatura de 300 °C a 410 °C en todas las muestras. Cuando se agregaron mayores cantidades de Ti64 a las muestras de PLA puro, todas las temperaturas mencionadas anteriormente disminuyeron, lo que demuestra que las partículas aceleraron la degradación del PLA16. Las partículas de Ti64 tienen una gran cantidad de sitios activos, así como agua adsorbida y absorbida en sus superficies, por lo que actúan como catalizadores de despolimerización para la degradación del PLA50. Otra razón probable se puede atribuir a la pérdida de peso molecular y la presencia de cadenas más cortas16. Cabe señalar que, a pesar del cambio a la baja en las temperaturas de degradación de las muestras de PLA cargadas con Ti64, los valores medidos siguen estando por encima de las temperaturas de extrusión e impresión 3D (temperaturas de ventana), que son 195 y 210 °C, respectivamente, lo que demuestra que las muestras ' excelentes capacidades de impresión. Además, la masa remanente calculada a partir del análisis fue bastante consistente con los valores nominales de los filamentos compuestos con un contenido de relleno de hasta el 6 % en peso, que muestran que las partículas de Ti64 se dispersan uniformemente dentro de la matriz de PLA. Sin embargo, la diferencia entre los valores obtenidos y calculados para el 9% en peso de Ti64 es un signo de distribución no homogénea de partículas en el PLA observada en los resultados de FESEM27.

Resultados de TGA (a–c), curvas de viscosidad de corte (d) y MFI (e) obtenidos de filamentos compuestos PLA-Ti64.

Las propiedades reológicas y de fluidez también se consideran generalmente dos factores esenciales para la evaluación de la procesabilidad por extrusión del material y la capacidad de impresión de polímeros y compuestos poliméricos57,58. Como se muestra en la Fig. 4d, la curva de flujo de todos los filamentos mostró un rango de viscosidad cero seguido de una disminución exponencial de la viscosidad medida, lo que indica un comportamiento de adelgazamiento por cizallamiento a velocidades de cizallamiento más altas. En este estudio, se utilizó un diámetro de boquilla de d = 0,4 mm a una velocidad de impresión de v = 35 mm/s, de modo que se estimó que la tasa de corte de impresión aproximada era \(\dot{\gamma }\) ≈ v⁄d ≈ 90 s−1 59. Por lo tanto, la notable característica no newtoniana de los filamentos asegura una reducción significativa de la viscosidad en la boquilla durante el flujo del material a la tasa de corte de impresión estimada y, posteriormente, un rápido aumento de la viscosidad cuando se deposita el material en la cama. Además, la viscosidad del PLA puro se redujo cuando se incorporó con micropartículas de Ti64. La reducción de la viscosidad en los filamentos compuestos se puede atribuir al papel de las partículas de tamaño micrométrico en la reducción de la fricción del fundido y la degradación de las cadenas de moléculas de PLA, lo que se confirmó mediante análisis termogravimétrico (TGA)50,59. Aunque se encontró que los valores de viscosidad de los filamentos compuestos eran más bajos que los del PLA puro, las cifras aún se encuentran en el rango de 100 a 300 Pa.s. Según la literatura, dicho rango de viscosidad puede garantizar la fluidez de los materiales y conservar la integridad estructural durante y después del proceso de impresión, respectivamente 59. La figura 4e ilustra los resultados de las pruebas del índice de fluidez (MFI) para filamentos compuestos de PLA y PLA-Ti64. De manera similar a la tendencia observada en el estudio reológico, los valores promedio de MFI para los compuestos fueron superiores al PLA puro. Además, el MFI aumentó ligeramente con el contenido de Ti64, variando de 24 a 31 (g/10 min). Estos resultados muestran que los valores de MFI caen dentro de la ventana de imprimibilidad en la técnica de extrusión de material45. La mayor fluidez de la matriz PLA/Ti64 generó capas delgadas y uniformes durante la impresión 3D.

Los andamios impresos en 3D requieren propiedades mecánicas aceptables para ser utilizados en aplicaciones BTE. Con respecto al hecho de que el PLA puro con propiedades mecánicas deficientes no ha logrado exhibir un gran potencial en aplicaciones de base biológica, se incrustaron refuerzos resistentes de Ti64 a través de la matriz para fortalecer las propiedades mecánicas del PLA puro. Se realizaron pruebas de compresión y tracción para explorar el efecto del Ti64 en las propiedades mecánicas del PLA puro. Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 2. Como se ve en la Fig. 5a-d, cuando aumentó la concentración de relleno, el módulo de tracción de la matriz PLA (1,3 GPa) aumentó considerablemente y alcanzó el valor de 2,0 GPa para PLA-9Ti64. También se encontró que la adición de relleno es eficaz para mejorar la resistencia a la tracción máxima y el alargamiento de PLA, que fueron 31,4 MPa y 3,9, a 35,1 MPa y 5,4 para la muestra PLA-3Ti64. Sin embargo, la tendencia al alza de estos parámetros se invirtió y los valores medios disminuyeron ligeramente a 32,9 MPa y 4,1 para la muestra PLA-6Ti64, seguidos de una caída significativa a 30,5 MPa y 3,1 para PLA-9Ti64, que fue aproximadamente el mismo que el de los resultados obtenidos en PLA puro. También se observó un patrón similar en los resultados de compresión, con la diferencia de que la muestra PLA-6Ti64 adquirió el valor más alto de resistencia máxima a la compresión (Tabla 3 y Fig. 6a–d). Según estos resultados, estos andamios podrían utilizarse para hueso craneofacial60 y hueso trabecular61. Las razones que justifican el fortalecimiento observado en los resultados de tracción y compresión se pueden explicar de la siguiente manera. Según algunos trabajos, la débil unión entre los refuerzos y la matriz está directamente relacionada con malas propiedades mecánicas62. Como se discutió en los resultados de DSC, el cambio hacia abajo en el valor de Tc al aumentar la concentración de Ti64 es una evidencia valiosa para declarar que PLA encontró partículas de Ti64 como sitios preferibles para nuclearse, lo que probablemente demuestra la tendencia de PLA y Ti64 a ponerse en contacto63. Es importante tener en cuenta que esta interacción entre la matriz y el relleno permite que la carga adicional, que el PLA no pudo soportar, se transfiera de manera efectiva a las partículas de Ti64, lo que fortalece el composite64. Otra razón de este fenómeno puede estar relacionada con la excelente dispersión del relleno sin que surjan aglomeraciones y microhuecos en la superficie de los compuestos PLA-3Ti64 y PLA-6Ti64. Sin embargo, la disminución de la resistencia del compuesto PLA-9Ti64 puede ser consecuencia de algunas aglomeraciones y vacíos demostrados por las imágenes FESEM (Fig. 2). Con el fin de obtener una mejor comprensión del comportamiento mecánico de los materiales estudiados, se estudiaron y compararon las superficies de fractura de las muestras.

Curvas de tracción (a), módulo de tracción (b), resistencia última a la tracción (c) y elongación (d) de andamios compuestos PLA/Ti64 (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, * *** p < 0,0001). Micrografías FESEM de superficies de fractura de andamios PLA puro (e), PLA-3Ti64 (f), PLA-6Ti64 (g) y PLA-9Ti64 (h).

Curvas de compresión (a), módulo de compresión (b), resistencia máxima a la compresión (c) y elongación (d) de andamios compuestos PLA-Ti64 (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, * *** p < 0,0001).

Como se muestra en la Fig. 5e-h, aunque la superficie de fractura del PLA puro era lisa, lo que demuestra que el PLA experimentó una fractura frágil, se observó una cantidad notable de hoyuelos y áreas deformadas plásticamente en la superficie de los compuestos, que son representativos de dúctil. fractura65,66. Este resultado es directamente consistente con la mejora de la ductilidad (alargamiento) en los ensayos de tracción. Además, aparte de dos tipos de porosidades, incluidos los poros de gas (formados durante el paso de fabricación del filamento (Tipo A)) y los poros triangulares entre capas (creados entre varias capas individuales durante el paso de impresión (Tipo B)), existe otro tipo de porosidad. creado por la extracción de partículas de Ti64 durante la prueba de tracción (Tipo C)65. Estos poros indican que, antes del desprendimiento de Ti64, la fuerza de tracción cargada se transfirió efectivamente de la matriz a los rellenos, mejorando así las propiedades mecánicas del PLA67.

Como resultado, aunque la temperatura de degradación térmica de los compuestos se elevó ligeramente cuando la concentración de Ti64 aumentó hasta un 6 % en peso, las propiedades mecánicas y la rigidez de estos compuestos mejoraron considerablemente. Sin embargo, la adición de 9% en peso de Ti64 al PLA no mejoró las propiedades mecánicas ni mejoró la degradación térmica. Por lo tanto, el intervalo óptimo de Ti64 se ajustó entre 3 y 6 % en peso.

Según múltiples encuestas, la superficie lisa e hidrofóbica de los polímeros es reacia a interactuar con diferentes grupos funcionales, actuando como elemento disuasorio contra la adhesión y proliferación celular68. Para superar este desafío, se empleó un tratamiento con plasma no térmico (PT) para modificar la superficie PLA-3Ti64 en presencia de aire y O2. Según los resultados del microscopio de fuerza atómica (AFM) presentados en las Fig. 7a y b, el ligero aumento en la rugosidad cuadrática media de la muestra PLA-3Ti64 (Rq: 1,8 nm) en comparación con la de PLA puro (Rq: 0,99 nm) probablemente esté relacionado con las pequeñas partículas de Ti64 depositadas en la superficie en la ventana estudiada de 10 µm × 10 µm. Después del tratamiento superficial de la muestra PLA-3Ti64 con O2 (Fig. 7c), la superficie se volvió más áspera y Rq alcanzó el valor de 35 nm, que era aproximadamente una quinceava parte del de la muestra no tratada. Sorprendentemente, se descubrió que el PT en el aire era más efectivo, ya que el Rq se duplicó aproximadamente (60 nm), lo que demuestra el increíble poder del tratamiento del aire para hacer rugosa la superficie (Fig. 7d).

Resultados de AFM de muestras impresas en 3D de PLA puro sin tratar (a), PLA-3Ti64 (b) sin tratar, PLA-3Ti64 (PT-O2) (c) y PLA-3Ti64 (PT-aire) (d). (Las imágenes (a–d) fueron generadas por el software NOVA https://www.ntmdt-si.com/products/afm-features/nova-px-control-program (NT-MDT, versión 1.0.26.1443)). ATR-FTIR de muestras no tratadas y tratadas (e).

El PT es capaz de bombardear superficies poliméricas con diversas especies, como iones, átomos y moléculas excitadas, que graban y modifican la superficie rompiendo las cadenas poliméricas y formando estructuras pico-valle repetitivas en la nanoescala69. Además, el PT puede tener un impacto significativo en la hidrofobicidad del PLA al alterar su superficie. Como se puede observar en las Fig. S2a y b, hubo una disminución en el ángulo de contacto de la muestra de PLA de 90,4 a 76,8° con la adición de partículas de Ti64, lo que puede estar relacionado con el aumento en la rugosidad del % en peso de PLA-3 Andamio Ti64 comparado con andamio PLA puro70. Cuando la muestra de PLA-3Ti64 se trató a través de ambientes de O2 y aire, los ángulos de contacto disminuyeron considerablemente y alcanzaron valores de 54° y 46°, respectivamente (Fig. S2c y d). Esta mayor hidrofilia de las muestras tratadas con plasma puede explicarse por los resultados de la espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (ATR-FTIR). La Figura 7e muestra el espectro ATR-FTIR para PLA puro, PLA-3Ti64, PLA-3Ti64 tratado con O2 y PLA-3Ti64 tratado con aire. El pico a 1080 cm−1 se atribuye al enlace –O–C=O. A 1181 cm−1, el pico observado es para estirar el enlace –CH–O. El pico a 1265 cm−1 proviene del enlace C–O del grupo éster en PLA71. Además, hay un pico pronunciado en 1745 cm−1, que es C=O. La principal diferencia entre la muestra compuesta y el PLA puro es que el pico de 1745 cm−1 disminuyó ligeramente cuando se añadió Ti64. Según algunos trabajos previos, cuando se disminuye la intensidad de un pico a 1745 cm−1, probablemente se produzca una interacción parcial entre dos compuestos, PLA y Ti6472,73,74. Cuando las muestras se trataron con plasma con O2 y aire, la intensidad de los enlaces que contenían oxígeno, incluidos –O–C=O, –CH–O, C=O y C–O, aumentó directamente asociado con la cantidad de oxígeno. cautiverio. A medida que los iones, los átomos y las moléculas excitadas inciden en la superficie del PLA, graban la superficie y provocan la ruptura de las cadenas de polímero. Estos sitios comienzan a interactuar con el aire para crear compuestos que contienen oxígeno. Además, la aparición de picos de absorción entre 3650 y 3300 cm−1, a 950 cm−1 y 832 cm−1, así como otro pico intensificado a unos 1370 cm−1 después del tratamiento, probablemente se puede atribuir a las vibraciones de estiramiento del OH responsables para aumentar la hidrofilia de las muestras75,76,77.

La eficacia de incorporar micropartículas de Ti64 en andamios de PLA se estudió mediante un experimento de supervivencia celular. La Figura 8a ilustra el análisis de viabilidad celular en los días 1, 3 y 5 al sembrar WJ-MSC en andamios, lo que indica que los andamios basados ​​en PLA desarrollados poseen una viabilidad celular aceptable en comparación con la muestra de control.

Estudio de viabilidad y proliferación celular. Análisis de ensayo MTT (a), tinción DAPI (b–e) y análisis SEM (f–i) de muestras fabricadas después de 5 días de cultivo celular. (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

La muestra de PLA puro mostró una tendencia similar en los días 1, 3 y 5, en comparación con el control, mientras que la incorporación de 3 y 9 % en peso de Ti64 afectó la viabilidad celular de manera diferente, lo que resultó en la cantidad más alta y más baja en el día 1, respectivamente. La muestra PLA-6Ti64 posee un valor de viabilidad celular entre PLA-3Ti64 y PLA-9Ti64. Sin embargo, los resultados obtenidos indican que la modificación con plasma en los andamios PLA-3Ti64 fabricados resultó en una menor viabilidad celular el día 1 (91.281 y 97.268, con O2 y aire, respectivamente) en comparación con la muestra PLA-3Ti64 de repuesto.

En el día 3, la máxima viabilidad celular se dedicó a las muestras tratadas con plasma y PLA puro con aire, con una mejora estadísticamente significativa (p < 0,0001). Por el contrario, el andamio más dañino para la viabilidad celular fue PLA-6Ti64. Además, se encontró que las muestras tratadas con plasma con aire tenían la viabilidad celular más alta el día 5, con una cantidad significativamente mayor (p < 0,0001) que otras muestras.

Con base en los resultados obtenidos, fue evidente que la incorporación de las micropartículas de Ti64 afecta la viabilidad de las células, y el aumento de su contenido también tuvo un impacto más sustancial. Podría justificarse por los iones y moléculas que liberaron las micropartículas aditivas78; por tanto, dependiendo de las micropartículas utilizadas, los resultados variarían. Lee et al.27 informaron que, en comparación con las células unidas a andamios de PLA puro, se demostró que las que estaban en andamios compuestos de PLA/Ti se estiraban y se extendían más, y también aumentaba su proliferación. Su trabajo sugirió que el aumento del contenido de Ti del 0 al 15% en volumen provocó una mejora en la viabilidad celular, la proliferación y la diferenciación osteogénica, en comparación con los andamios de PLA puro.

En cuanto a la modificación de la superficie de los andamios impresos en 3D preparados, se demostró que el tratamiento con plasma aumentó ligeramente la viabilidad celular, lo que fue muy similar a estudios anteriores. Roh et al.43 indicaron que el tratamiento con plasma podría alterar el comportamiento de las células al alterar la morfología de la superficie y las características químicas del andamio 3D. Parece que el ajuste de la superficie de los andamios y el aumento de la rugosidad dan como resultado un aumento en el potencial de unión de las células, lo que afecta la supervivencia y la propagación de las células79.

En consecuencia, los andamios al 6 y al 9% en peso se omitieron de más pruebas celulares para realizar pruebas aplicables y desarrollar andamios óseos aumentados. La evaluación se realizó considerando cuatro especímenes, incluidos PLA puro, PLA-3Ti64, PLA-3Ti64 (PT-O2) y PLA-3Ti64 (PT-aire).

El 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), una tinción fluorescente conveniente, hace que el ADN nuclear sea detectable tanto en células vivas como fijadas80. Se identificaron los núcleos y se evaluó la morfología celular general mediante la tinción con DAPI 21 días después de la siembra de células en los andamios (Fig. 8b-e). Como ilustran estas figuras, los andamios compuestos PLA-3Ti64 mostraron una mayor propagación y proliferación celular en comparación con los andamios PLA puros. Además, los resultados indicaron que la agrupación de células en andamios tratados con plasma produjo una mayor proliferación y propagación celular, mientras que la muestra de PLA-3Ti64 (PT-aire) tuvo una mayor proliferación celular que las muestras tratadas con plasma con O2. Al mismo tiempo, ambos son superiores en comparación con las muestras compuestas y puras sin tratar. Los resultados obtenidos se correlacionan con hallazgos previos, lo que confirma que una mayor rugosidad de la superficie da como resultado una mayor unión, propagación, proliferación y funcionalización de las células79. Wang et al.81 informaron que sus intentos de ajustar la superficie de los andamios basados ​​en PLA impresos en 3D a través del tratamiento con plasma aumentaron la hidrofilia y la rugosidad a nanoescala, lo que impulsó considerablemente la diferenciación de osteoblastos y la adhesión y proliferación de células estromales mesenquimales. En este trabajo, como se discutió anteriormente, la rugosidad superficial de PLA-3Ti64 (PT-aire), PLA-3Ti64 (PT-O2), PLA-3Ti64 y PLA puro fue de 60, 35, 1,8 y 0,99 nm, respectivamente. Teniendo en cuenta los datos y los resultados, la unión celular, la propagación, la proliferación y la morfología son considerables en las muestras tratadas con plasma, específicamente en la muestra tratada con plasma de aire. Nuestros hallazgos sobre la proliferación celular en andamios de PLA muestran que el tratamiento de la superficie con plasma promueve la proliferación celular. Las superficies a escala nanométrica generadas por el tratamiento con plasma aumentaron la adhesión celular, la proliferación e incluso alteraciones morfológicas en la superficie del andamio, como lo muestran los datos de proliferación celular de WJ-MSC. Estos hallazgos se confirmaron mediante imágenes SEM de especímenes adheridos a células fijas (Fig. 8f-i).

Para investigar la influencia del tratamiento con plasma en la actividad osteogénica de las WJ-MSC sembradas en andamios compuestos PLA/Ti64 impresos en 3D, se midió la actividad de la enzima ALP, que corresponde a la etapa temprana de la diferenciación osteogénica82. La Figura 9a muestra la actividad de la enzima ALP de las WJ-MSC sembradas en los andamios fabricados durante 7 y 14 días. Con respecto a los 7 días, se encontró que la incorporación de 3% en peso de Ti64 en el sustrato PLA aumentó la actividad de la enzima ALP, mientras que esta mejora no es estadísticamente significativa. Por otro lado, el tratamiento de la superficie con plasma de los andamios compuestos elevó significativamente la actividad de la enzima ALP, en comparación con las muestras de PLA puro (p < 0,01), mientras que PLA-3Ti64 (PT-aire) o PLA-3Ti64 (PT-O2) no tuvieron diferencias significativas entre sí. Sin embargo, la situación cambió en 14 días después del cultivo celular en los andamios impresos en 3D desarrollados. Los andamios PLA-3Ti64 demostraron una cantidad significativamente elevada de actividad de la enzima ALP en comparación con las muestras de PLA puro (p < 0,0001), mientras que PLA-3Ti64 (PT-O2) no tuvo una mejora significativa en comparación con la muestra compuesta. Curiosamente, las muestras tratadas con plasma con aire mostraron una mejora considerable en la actividad de la enzima ALP en comparación con las muestras de PLA puro y tratadas con plasma O2 (p < 0,0001).

Estudio de diferenciación osteogénica. Análisis de actividad ALP (a), análisis de tinción ARS (b) y tinción ARS a los 7 días (c–f) y 14 días (g–j) después del cultivo celular. (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

Los osteoblastos maduros producen y depositan la matriz mineral, que comprende principalmente fosfato de calcio en forma de hidroxiapatita, como etapa final de la diferenciación de los osteoblastos. La capacidad de las WJ-MSC para mineralizar el calcio inorgánico en medio de la fase de diferenciación, medida por el depósito de minerales inorgánicos, indica una diferenciación osteogénica. En este estudio, los resultados de la tinción con ARS ilustraron la acción beneficiosa de los andamios modificados en la superficie del plasma sobre la mineralización de la matriz extracelular (MEC) de los osteoblastos. La Figura 9b muestra el diagrama de análisis de la tinción con ARS para las WJ-MSC sembradas en muestras preparadas durante 7 y 14 días. Se observó que la DO media en 405 nm para las muestras de PLA puro fue de 0,2598 el día 7, mientras que aumentó a 0,3572 para el sustrato PLA-3Ti64. Además, la modificación de los atributos de la superficie de los andamios mediante tratamiento con plasma mejoró el contenido de calcio depositado a 0,4402 y 0,4662 para las condiciones de O2 y aire, respectivamente. La Figura 9c-f muestra el contenido de calcio depositado de las células diferenciadas en los andamios preparados durante 7 días. Los resultados cualitativos obtenidos validan los análisis numéricos, mientras que los resultados de la tinción ARS se correlacionan positivamente con el ensayo ALP.

El punto interesante de esta prueba es que, el tratamiento superficial de las muestras con plasma en condiciones de O2 y aire aumentó la cantidad de contenido de calcio a 0,6988 y 0,768, respectivamente, a los 14 días; lo que significa que la deposición de calcio aumentó significativamente con el desbaste de la superficie y una mejor unión, proliferación, actividad y diferenciación celular, en comparación con los andamios desnudos (Fig. 9g-j).

Se puede explicar el potencial del andamio osteogénico examinando cómo el tratamiento de la superficie con plasma altera el microambiente de la superficie. Dado que se ha demostrado que el comportamiento celular está influenciado por la estructura de la superficie del andamio, la composición química del andamio le confiere sus capacidades biológicas83. En esta investigación, como se mencionó anteriormente, se puede encontrar que el tratamiento con plasma de los andamios mejoró la rugosidad de la superficie y alteró la composición química de la superficie (Fig. 7a-e). Sorprendentemente, podría violarse el hecho de que el aumento de la rugosidad de la superficie mejoraría la unión, la propagación, la proliferación y la diferenciación de las células, según el material, la estructura, el tipo de tratamiento con plasma y las células utilizadas84.

Este estudio demostró la impresión 3D exitosa de andamios compuestos PLA-Ti64 con poros interconectados. Los efectos de agregar diferentes cantidades (3, 6 y 9 % en peso) de Ti64 a PLA sobre las propiedades mecánicas y biológicas, así como los efectos del tratamiento con plasma con oxígeno y aire sobre la mejora adicional de las propiedades biológicas de los andamios PLA-Ti64 , en términos de unión celular, proliferación y diferenciación. Las principales conclusiones pueden resumirse como sigue.

La falta de defectos perjudiciales, incluidas microfisuras, delaminación y vacíos en los puntales de los andamios impresos, manifestó la alta calidad de las muestras impresas.

La adición de Ti64 al PLA en un 6% en peso mejoró significativamente todas las propiedades mecánicas, incluido el módulo de compresión, la resistencia máxima a la tracción y la ductilidad.

La temperatura de transición vítrea aumentó con el aumento del contenido de Ti64, lo que indica que Ti64 influyó en parte en sus propiedades térmicas. Sin embargo, hubo una disminución en la degradación, cristalización y temperatura de fusión.

El tratamiento con plasma aumentó la hidrofilia y la rugosidad de la superficie del andamio PLA-Ti64. A este respecto, se encontró que el tratamiento con plasma con aire era más eficaz.

La adición de partículas de Ti64 en combinación con el tratamiento con plasma dio como resultado una mejor adhesión, proliferación y diferenciación de las células madre mesenquimales de la gelatina de Wharton.

Los resultados obtenidos indican que, entre las diferentes muestras estudiadas, los andamios PLA-3Ti64 (PT-aire) mostraron mejores propiedades mecánicas y de bioactividad y cumplieron con los criterios ideales para los sustitutos de ingeniería de tejido óseo.

Gránulos de ácido poliláctico (PLA 4032D, NatureWork LLC, EE. UU.) con un peso molecular promedio (Mw) de 19 600 kg/mol, polvo esférico de Ti64 de grado 23 (AP&C, Canadá) con un rango de distribución de tamaño de 10 a 50 micrones (Fig. S3) y diclorometano (DCM, grado biotecnológico 99,9 %, Sigma-Aldrich, Alemania) para preparar compuestos PLA/Ti64. Los detalles del método de fabricación de filamentos se explican en otra parte85 y se describen brevemente aquí. Inicialmente, los gránulos de PLA se colocaron en un horno a 60 °C durante 6 h para erradicar la humedad. Luego, el polvo de Ti64 con tres concentraciones diferentes (3, 6 y 9 % en peso) se vertió en un vaso de precipitados que contenía 10 ml de DCM y se agitó durante 1 h para promover la dispersión. Después de eso, los compuestos resultantes se mezclaron con gránulos de PLA secos mediante una batidora manual para distribuir uniformemente la mezcla de DCM/Ti64 en la superficie de los gránulos de PLA. Las mezclas de PLA/Ti64 obtenidas se colocaron en el horno a 70 °C durante 16 h para eliminar el DCM. Luego, las muestras secas finales se agregaron a una extrusora de un solo tornillo equipada con dos boquillas (temperatura de 195 °C) y una velocidad de tornillo de 35 rpm para preparar los filamentos finales de PLA/Ti64 con un diámetro de 1,75 mm. Se instalaron dos ventiladores en la boquilla de salida para descender la temperatura de los filamentos. Finalmente, los filamentos provenientes de la boquilla de salida se enrollaron alrededor de un carrete. La Fig. S4 muestra la imagen de los filamentos extruidos de PLA puro y PLA/6 % en peso de Ti64.

Para imprimir andamios, se utilizó una configuración de extrusión de material comercial (Dayan K12S, Borna3D Inc., Irán) con un tamaño de boquilla de 400 µm. Al principio, los andamios se diseñaron con el software Solidwork (versión 23.0) en la dimensión cúbica de 1 × 1 × 0,8 cm con un ancho de puntal y un tamaño de poro de 400 µm y 300 µm, respectivamente. Luego, mediante el uso del software MankatiUM (versión 6.5), varios parámetros de impresión, incluida la velocidad de impresión (35 mm/s), la temperatura de la boquilla (210 °C), la temperatura de la cama (55 °C), la altura de la capa (300 µm), y patrón de relleno (−45°/ + 45°). Para alcanzar la porosidad nominal del 40%, el porcentaje de relleno de las muestras se fijó en el 60%. El proceso de impresión fue seguido por un rodillo de presión que empujaba los filamentos hacia la boquilla calentada. Luego, el filamento se fundió y se inyectó a través de la boquilla, y la masa fundida se depositó en una cama de impresión precalentada. Finalmente, las muestras se despegaron del lecho y se caracterizaron mediante múltiples pruebas.

Con el fin de mejorar la rugosidad de la superficie y promover la unión celular, se realizaron tratamientos con plasma de oxígeno y aire con un sistema de tecnología de superficie de plasma de baja presión (Zepto11, Diener, Alemania) utilizando una radiofrecuencia (RF) de 13,56 MHz. La potencia de descarga de RF, las tasas de flujo de gas de O2 y aire, y la presión de trabajo RIE fueron 75 W, 15 sccm (centímetro cúbico estándar por minuto) y 225 × 10−3 Torr, respectivamente. Ambos lados de los andamios impresos en 3D se trataron durante 6 min.

FESEM (Tescan Mira3, República Checa) equipado con EDX se utilizó para evaluar la morfología y/o la composición química de polvos, filamentos, andamios impresos en 3D, superficies de fractura y también para estudios de fijación de células Ti64. La superficie de las muestras se recubrió primero con oro mediante recubrimiento por pulverización catódica para hacer que la superficie sea conductiva y evitar la acumulación de carga eléctrica en la superficie durante SEM. También se utilizó un microscopio estereoscópico con zoom (SZ51, Olympus, Japón) para evaluar la calidad de la superficie de los andamios impresos en 3D. Se utilizó AFM (TS-150, NT-MDT, Rusia) para investigar la topografía y la rugosidad de los andamios impresos en 3D tratados con plasma y sin tratar. Las imágenes AFM se capturaron en el modo de tapping a temperatura ambiente, y la raíz cuadrada media (RMS) se calculó utilizando el software NOVA (versión 1.0.26.1443).

Se realizó un análisis TGA (TA Instruments Q50, EE. UU.) para estudiar la estabilidad térmica de los filamentos de biocompuestos. Para lograr esto, se colocaron 10 mg de cada muestra en un crisol de alúmina y se calentaron a una velocidad de 10 °C/min de 30 a 510 °C bajo una atmósfera de argón. También se realizó análisis DSC (TA Instruments Q100, EE. UU.) para evaluar el grado de cristalinidad de los materiales y su comportamiento de fusión y cristalización. En este sentido, se calentaron 10-15 mg de cada muestra de 30 a 210 °C con una velocidad de calentamiento de 10 °C/min bajo una atmósfera de argón. El grado de cristalinidad (XC) se determinó mediante la siguiente ecuación. 86:

donde ΔHm, ΔHc y ΔH0 son las entalpías de fusión, cristalización en frío y PLA 100 % cristalino (93,1 J/g), respectivamente.

La medición de la viscosidad de cizallamiento se investigó utilizando un reómetro de rotación Anton Paar MCR 301 con geometrías paralelas (diámetro de la placa = 25 mm, separación = 1 mm) a 210 °C. La prueba MFI de filamentos se llevó a cabo de acuerdo con la norma ASTM D1238 utilizando un aparato Geotech GT-7100-MI. Para ello, se aplicaron al émbolo 2,16 kg de la carga y se mantuvo la temperatura del cilindro a 210 °C. Finalmente, se observó el material que volaba a través de la boquilla durante 10 minutos de prueba.

La estructura cristalina de las fases en andamios impresos en 3D se examinó mediante análisis XRD. La DRX con radiación Cu-Kα filtrada (longitud de onda de 1,5405 Å) se llevó a cabo con un instrumento Philips PW1730 a una corriente de 30 mA y un voltaje de 40 kV en el rango de 2θ de 5 a 80°.

Los grupos funcionales químicos de los andamios PLA/Ti64 y sus cambios a través del tratamiento con plasma se estudiaron mediante FTIR (Thermo, EE. UU.). Los espectros FTIR se recolectaron con un espectrómetro Perkin Elmer en el rango de 4000 cm−1 a 400 cm−1, utilizando un módulo de reflectancia total atenuada (ATR).

Se empleó la medición del ángulo de contacto (WCA, Veho USB Microscope 400X, China) para evaluar la hidrofilia de varias muestras. En este sentido, se dejaron caer 10 µL de agua destilada sobre la superficie propuesta. El experimento se repitió para cada muestra y se informaron los resultados promedio.

Se llevaron a cabo pruebas de tracción y compresión en especímenes impresos en 3D de acuerdo con las normas ASTM D638 y D695 para determinar las propiedades mecánicas de los compuestos PLA/Ti64. Se utilizó una máquina de ensayo universal Santam (STM-20, Santam Co., Irán) para aplicar fuerzas de tracción y compresión a velocidades de cruceta constantes de 5 mm/min y 1,3 mm/min, respectivamente, a temperatura ambiente. Los experimentos se repitieron al menos tres veces para investigar la reproducibilidad de las muestras y se informaron los valores medios.

Se compraron células madre mesenquimales de gelatina de Wharton (WJ-MSC) de la empresa SinaCell (Irán) y se sometieron a una prueba de MTT después de haber estado expuestas a dosis variables de andamios impresos en 3D PLA-Ti64. Para lograr este objetivo, se sembraron 1 × 104 células en placas de cultivo de 96 pocillos y se expusieron a los andamios prescritos después de un día de cultivo. Después de 1, 3 y 5 días, cada solución de MTT de 100 ml bien recibida (0,5 mg/ml) se incubó durante 3 h. Luego se retiró la solución de MTT y se reemplazó con 100 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Finalmente, la absorbancia de las muestras (a 570 nm) se midió por triplicado usando un lector de microplacas (BioTek Co., EE. UU.), y los hallazgos de viabilidad se calcularon contra la muestra de control y se proporcionaron como un porcentaje de viabilidad celular.

Para el análisis SEM, las células se fijaron en la superficie de las muestras preparadas sumergiéndolas en glutaraldehído (2,5% en peso) durante una hora y luego enjuagándolas en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Posteriormente, la deshidratación se realizó sumergiendo la muestra a 37 °C durante 5 min en cada concentración de etanol (30, 50, 70, 80, 90, 95 y 99%). Después de recibir un recubrimiento de oro, las muestras se sometieron a análisis SEM de alto voltaje.

Para realizar un análisis de ensayo de ALP, se cultivaron WJ-MSC en andamios preparados a una densidad de 2 × 104 células por pocillo. Los grupos de control y prueba renovaron el medio de cultivo después de 24 h. El medio se tomó los días 7 y 14, y las células se lavaron dos veces con PBS, se lisaron en 200 l de TritonX-100 al 0,2 % y se congelaron/descongelaron tres veces a -20/37 °C cada una. Después de centrifugar los lisados ​​celulares durante 30 min a 3000 rpm, se transfirieron 50 l del sobrenadante a una placa nueva de 48 pocillos y se mezclaron con 200 l de solución de fosfato de p-nitrofenilo (Pars Azmoun Company, Irán) según las indicaciones del fabricante. La DO se midió a 405 nm utilizando un lector de microplacas.

La deposición de calcio de WJ-MSC se detectó mediante tinción con ARS. Se sembraron aproximadamente 4 × 104 WJ-MSC en los andamios preparados, cada andamio en cada pocillo de la placa de 24 pocillos, y los grupos de tratamiento renovaron el medio después de dos días. Las células se lavaron con PBS y se fijaron en formaldehído al 4 % durante 1 h después de 7 y 14 días. Después de otro lavado, las células se incubaron durante 40 min con rojo de alizarina al 2% en peso (Sigma-Aldrich, EE. UU.). A continuación, las células se lavaron cuatro veces con agua destilada antes de examinarlas con un microscopio invertido (Olympus, Japón).

En este trabajo, se realizó una evaluación inmunofluorescente para estudiar y analizar el ciclo celular y detectar núcleos celulares utilizando la tinción DAPI. Para investigar la ocurrencia de muerte celular y detectar si la muerte celular es de tipo apoptótico o no, se utilizaron microscopía de fluorescencia (Leica, TCS SP-8, Alemania) y tinción DAPI (empresa Sigma-Aldrich, Alemania). En esta tinción, las células normales se ven con un color azul uniforme. Sin embargo, los núcleos de las células apoptóticas se ven irregularmente como puntos azules brillantes debido a la condensación de la cromatina y la fragmentación del núcleo87. La solución de DAPI se preparó disolviendo 1 mg de DAPI en 1 mL de agua destilada. Para evaluar la muerte celular, las WJ-MSC sembradas en los andamios se cultivaron durante una hora antes de retirar la superficie celular, se lavaron con PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4 % y se tiñeron con DAPI a una densidad de 300 nm.

Todos los gráficos y análisis estadísticos se proporcionaron utilizando el software Origin (versión 2021). Los valores de P se calcularon a través del análisis de variación unidireccional con comparaciones múltiples de Bonferroni, donde P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Cada prueba se repitió al menos tres veces y los resultados se informaron como media ± desviación estándar (DE).

No se utilizaron humanos ni animales en este estudio.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles a los autores correspondientes previa solicitud razonable.

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Estos autores contribuyeron por igual: Motahareh Shabani Dargah y Mahdi Hasanzadeh Azar.

Departamento de Ciencia e Ingeniería de Materiales, Universidad Tecnológica de Sharif, Teherán, Irán

Masoud Zarei, Reza Alizadeh, Sayed Shahab Sayedain y Mohammad Asadollahi

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad Tecnológica de Amirkabir, Teherán, Irán

Motahareh Shabani Dargah

Departamento de Ingeniería Física, Universidad McMaster, Hamilton, Canadá

Mahdi Hasanzadeh Azar

Departamento de Ingeniería Biotecnológica, Facultad de Ciencias, Universidad de Teherán, Teherán, Irán

Fatemeh Sadat Mahdavi

Grupo de Investigación de Materiales Poliméricos (PMRG), Departamento de Ciencia e Ingeniería de Materiales, Universidad Tecnológica de Sharif, Teherán, Irán

Alireza Kaviani

Departamento de Ingeniería de Tejidos, Escuela de Tecnologías Avanzadas en Medicina, Universidad de Ciencias Médicas de Teherán, Teherán, Irán

Mahmoud Azami y Nima Beheshtizadeh

Grupo de Medicina Regenerativa (REMED), Red Universal de Investigación y Educación Científica (USERN), Teherán, Irán

Masoud Zarei, Mahmoud Azami y Nima Beheshtizadeh

Centro de Investigación de Reconstrucción Conjunta (JRRC), Universidad de Ciencias Médicas de Teherán, Teherán, Irán

mahmud azami

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Correspondencia a Masoud Zarei, Reza Alizadeh o Nima Beheshtizadeh.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Zarei, M., Shabani Dargah, M., Hasanzadeh Azar, M. et al. Regeneración mejorada del tejido óseo utilizando un andamio compuesto de poli(ácido láctico)/Ti6Al4V impreso en 3D con modificación del tratamiento con plasma. Informe científico 13, 3139 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30300-z

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Recibido: 01 Diciembre 2022

Aceptado: 21 de febrero de 2023

Publicado: 23 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30300-z

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