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Apr 29, 2023

Impresión 3D de compuestos basados ​​en nanocristales de celulosa para construir andamios biomiméticos robustos para la ingeniería de tejido óseo

Informes científicos volumen 12,

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 21244 (2022) Citar este artículo

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Los nanocristales de celulosa (CNC) están atrayendo cada vez más atención en los campos de la biomedicina y la atención médica debido a su durabilidad, biocompatibilidad, biodegradabilidad y excelentes propiedades mecánicas. En este documento, fabricamos utilizando andamios compuestos 3D de tecnología de modelado por deposición fundida a partir de ácido poliláctico (PLA) y CNC extraídos de Ficus thonningii. La microscopía electrónica de barrido reveló que los andamios impresos exhiben poros interconectados con un tamaño de poro promedio estimado de aproximadamente 400 µm. La incorporación de un 3 % (p/p) de CNC en el compuesto mejoró las propiedades mecánicas del PLA (el módulo de Young aumentó un ~30 %) y la humectabilidad (el ángulo de contacto con el agua disminuyó un ~17 %). Se validó el proceso de mineralización de andamios impresos usando fluido corporal simulado y se confirmó la nucleación de hidroxiapatita. Además, las pruebas de citocompatibilidad revelaron que los andamios de PLA basados ​​en CNC y PLA no son tóxicos y son compatibles con las células óseas. Nuestro diseño, basado en la impresión 3D rápida de compuestos PLA/CNC, combina la capacidad de controlar la arquitectura y proporcionar propiedades mecánicas y biológicas mejoradas de los andamios, lo que abre perspectivas para aplicaciones en ingeniería de tejido óseo y en medicina regenerativa.

El desarrollo de materiales para la ingeniería ósea sigue siendo un desafío debido a la complejidad de la estructura ósea natural y el entorno biomecánico. Para reparar el tejido óseo dañado, se recolectan autoinjertos de diferentes huesos y se usan para reemplazar los huesos faltantes. Menos aloinjertos disponibles son desalentadores1,2,3, y las uniones artificiales utilizadas como implantes a menudo tienen que retirarse después de la cicatrización4. Recientemente, han surgido nuevas estrategias de reparación ósea, incluida la medicina regenerativa asistida por andamios utilizada para promover el crecimiento óseo5.

Un andamio óseo ideal debería ser una matriz tridimensional capaz de imitar la compleja composición y estructura del hueso para la adhesión y proliferación celular6. Por lo tanto, requiere alta biocompatibilidad, biodegradabilidad, no toxicidad, excelentes propiedades mecánicas y una arquitectura adecuada en términos de porosidad y tamaño de poro para integrarse con el tejido nativo del huésped7. La composición química y las características fisicoquímicas del andamio, que influyen directamente en el desempeño mecánico y biológico8, son, por lo tanto, parámetros importantes a estudiar.

Los biopolímeros sintéticos se han utilizado ampliamente en la ingeniería de tejidos óseos debido a su biocompatibilidad y su capacidad para controlar las propiedades fisicoquímicas del andamio. Se componen de poliésteres alifáticos como el ácido poliglicólico (PGA), la policaprolactona (PCL) y el ácido poliláctico (PLA)9. Desafortunadamente, son bastante quebradizos y normalmente pierden su fuerza debido a la rápida degradación in vivo. Además, su naturaleza hidrófoba dificulta la fijación y proliferación de las células óseas10. Para superar estas limitaciones, los andamios basados ​​en polímeros sintéticos, concretamente PLA o PCL, pueden mejorarse incorporando refuerzos de polímeros naturales como celulosa11,12,13,14,15, alginato16, gelatina17, quitosano18,19 o queratina20 conocidos por sus interesantes características.

Se utilizan varias técnicas, que incluyen colada con disolventes y lixiviación de partículas, liofilización en emulsión, separación de fases o electrohilado21,22,23, para desarrollar andamios para la ingeniería de tejidos duros. Sin embargo, no permiten un control eficiente de la morfología y la porosidad.

La fabricación aditiva ha demostrado ser una técnica de elección para diseñar y preparar materiales de reparación ósea biomiméticos. Las arquitecturas de andamios controlados en 3D afectan significativamente las propiedades mecánicas, así como la adhesión y proliferación de células óseas2,24,25,26,27,28. Por lo tanto, varios trabajos se han centrado en el desarrollo de andamios impresos en 3D utilizando diversas tecnologías, como la estereolitografía, el trazado 3D, la sinterización selectiva por láser, la bioimpresión y el modelado por deposición fundida (FDM). FDM es la tecnología de fabricación aditiva más utilizada. Es una técnica sencilla, rápida y de bajo coste que ofrece grandes posibilidades para el manejo de polímeros.

Varios estudios han investigado el refuerzo de PLA con nanomateriales como óxido de grafeno29, nanorrellenos de nitruro de boro (BN)21, nanohidroxiapatita30,31,32 para mejorar las propiedades mecánicas y bioactivas del andamio polimérico. La celulosa es un material prometedor para aplicaciones biomédicas, incluida la ingeniería de tejidos, la investigación con células madre y la medicina regenerativa33,34,35,36,37 debido a su excelente biocompatibilidad, biodegradabilidad favorable, buenas propiedades mecánicas, alta área de superficie específica, baja densidad y no naturaleza abrasiva38,39,40,41. En particular, los nanocristales de celulosa (CNC) son eficaces para aplicarse como agentes de refuerzo o nanorrellenos en el diseño de andamios y los resultados confirmaron que los CNC mejoran significativamente el rendimiento mecánico y la citocompatibilidad de los andamios38,39,42,43. Además, CNC tiene muchos grupos hidroxilo que pueden formar enlaces de hidrógeno intermoleculares con grupos carbonilo de PLA para lograr una adhesión interfacial favorable. Mezclar PLA con biopolímeros como la celulosa mejora las propiedades del PLA sin alterar su biocompatibilidad. Los compuestos PLA/celulosa se han desarrollado ampliamente y se han publicado estudios sobre propiedades estructurales, térmicas y mecánicas12,44,45,46,47,48,49,50,51. Sin embargo, aunque los nanocompuestos de PLA y celulosa se informan en la literatura para aplicaciones de ingeniería de tejidos, creemos que todavía hay espacio para desarrollar andamios 3D para ingeniería de tejidos por FDM, que es una técnica de fabricación aditiva rápida y de bajo costo, especialmente para superar ciertas limitaciones. encontradas en el PLA, a saber, la resistencia mecánica del biopolímero.

Por lo tanto, este trabajo tiene como objetivo desentrañar el efecto del contenido CNC en los andamios PLA/CNC procesados ​​por FDM y su influencia en las propiedades estructurales, superficiales y mecánicas finales de los biocompositos. Se realizaron pruebas de biomineralización, biodegradabilidad in vitro y citocompatibilidad en el PLA/CNC3 resultante (es decir, con 3% (p/p) de CNC incorporado en el material compuesto). El material resultante es un andamio mejorado mecánicamente que ofrece grandes oportunidades para el diseño y la producción rápida de andamios 3D biomiméticos con propiedades biológicas apropiadas.

Las imágenes de Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) reportadas en la Fig. 1 muestran claramente filamentos puros de PLA con una superficie lisa y regular, mientras que los de los compuestos son rugosos debido a la formación de agregados relacionados con la presencia de CNC. De hecho, la evolución de la superficie del PLA, tras la incorporación del CNC, de un estado liso a un estado rugoso podría sugerir una buena dispersión del CNC sobre toda la superficie del PLA. La incorporación de más del 3% (p/p) de CNC da como resultado la formación de partículas grandes, lo que podría conducir a menos enlaces de hidrógeno entre la matriz (PLA) y el refuerzo (CNC). De hecho, la dispersión de CNC en PLA es baja debido a la naturaleza hidrofílica de la celulosa frente a la naturaleza hidrofóbica del PLA, lo que dificulta su interacción y dispersión uniforme52.

Imágenes SEM de filamentos compuestos de PLA y PLA/CNCx extruidos.

Los filamentos compuestos, resultantes de la hibridación de PLA, presentan buenas capacidades para mejorar la unión y proliferación celular. En este sentido, los composites PLA/CNC son buenos candidatos para aplicaciones biomédicas, particularmente en regeneración ósea. De hecho, los rellenos de celulosa (CNC) podrían crear importantes sitios de unión y proliferación celular para cualquier material de andamiaje implantable en la ingeniería de tejidos duros. Ya se han realizado varios estudios para desarrollar filamentos compuestos PLA/CNC por extrusión monotornillo imprimibles por FDM52,53,54. Sin embargo, el desarrollo de filamentos PLA/CNC para la producción de andamios híbridos para aplicaciones biomédicas sigue siendo nuevo para nuestro conocimiento.

El análisis de espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (FTIR) de los filamentos se muestra en la Figura S1 en Información complementaria. Nuestros resultados muestran un ligero aumento en las intensidades de los picos con el aumento de la carga del CNC dentro de la matriz PLA, lo cual está de acuerdo con la literatura52. Las diferencias más significativas se observaron en 2946, 1743 y entre 1500 y 1000 cm−1, que se atribuyen respectivamente al estiramiento de los enlaces CH, C=O, la vibración de estiramiento del carbonilo (C=O) y al CO de PLA55.

La descomposición de los filamentos CNC, PLA y los compuestos derivados se examinó a partir de las curvas de análisis termogravimétrico (TGA), termogravimetría derivada (DTG) y calorimetría diferencial de barrido (DSC) que se muestran en la Fig. 2. Se observa una ligera pérdida de peso entre 100 y aproximadamente 325 °C en todas las muestras debido a la deshidratación de los filamentos y despolimerización del PLA así como a la ruptura de los enlaces glucosídicos en la celulosa. En comparación con el PLA, los compuestos exhiben una mayor pérdida de peso debido a la naturaleza higroscópica de los compuestos después de la incorporación del CNC hidrofílico. Por lo tanto, cuando se someten a estrés térmico, los compuestos liberan la humedad absorbida, lo que resulta en una pérdida de peso relativamente alta. Además, se produce una fuerte pérdida de peso a 400 °C probablemente relacionada con la degradación de PLA y CNC. Las temperaturas de descomposición de inicio de CNC y los filamentos se observan a 225, 318,8, 311,8, 325,5 y 320,4 °C para CNC, PLA, PLA/CNC1, PLA/CNC3 y PLA/CNC5, respectivamente. Por lo tanto, los filamentos desarrollados pueden procesarse a temperaturas que alcanzan los 300 °C sin dañarlos. Por lo tanto, la temperatura de impresión de 200 °C utilizada en nuestro estudio parece ser óptima para desarrollar andamios PLA/CNC. Sin embargo, el CNC no mejora significativamente la estabilidad térmica del PLA. Además, las curvas DTG muestran un descenso en la temperatura máxima de degradación de los composites respecto a la del PLA puro. La degradación máxima de PLA/CNC3 ocurre en un rango de temperatura (T) de aproximadamente 365–374 °C mientras que la de PLA, PLA/CNC1 y PLA/CNC5 ocurre en T = 373,39, 370,62 y 369,22 °C, respectivamente. De hecho, la temperatura de degradación relativamente amplia de PLA/CNC3 se puede atribuir a la mejor hibridación del compuesto reflejada por una mejor interacción entre el 3% de CNC y PLA.

Análisis térmico de filamentos extruidos PLA y PLA/CNCx. (a) análisis termogravimétrico (TGA, bajo nitrógeno desde temperatura ambiente hasta 800 °C a una velocidad de calentamiento de 10 °C min−1), (b) TGA derivada (DTG) y (c) calorimetría diferencial de barrido (curvas DSC, de temperatura ambiente a 250 °C con una velocidad de calentamiento de 20 °C min−1 bajo atmósfera de nitrógeno) mostrando la Tg, Tcc y Tm de PLA y los nanocompuestos.

Además, el análisis de las curvas DSC (Fig. 2c) de todas las muestras revela sucesivamente cambios de etapa endotérmicos (transición vítrea), seguidos de un pico exotérmico dedicado a la cristalización en frío y un pico endotérmico debido a la fusión. En comparación con el PLA, los filamentos compuestos muestran un desplazamiento de la transición vítrea, la cristalización en frío y los picos de fusión hacia las temperaturas más bajas. Esto sugiere que el CNC tiende a disminuir las temperaturas de cambio de estado del PLA (Tabla 1). De hecho, la gama de transición vítrea se amplía con el aumento de la carga CNC. Esto sugiere que la adición de celulosa aumenta la cristalinidad debido a la mayor movilidad de las cadenas de PLA56. Esto es consistente con los cálculos del grado de cristalinidad presentados en la Tabla 1. La adición de 3 % (p/p) de CNC en la matriz de PLA provocó un rango de transición vítrea más amplio con un pico más débil, lo que indica una mejor interacción entre CNC y PLA. y por lo tanto podría reflejar una buena dispersión y buena adhesión interfacial.

En la Información complementaria, las Figuras S2 y S3 muestran el análisis térmico de CNC y de PLA y PLA/CNC3 impresos en 3D, respectivamente, lo que demuestra que PLA no presenta termodegradabilidad cuando se imprime.

Los andamios implantables para aplicaciones biomédicas requieren atributos específicos para realizar mejor las funciones de los órganos nativos y ayudar a regenerar el tejido dañado. Entre sus atributos, las propiedades mecánicas siguen siendo las más cruciales para apoyar el proceso de regeneración. Varios autores han investigado andamios que combinan varios materiales para proporcionar una sustitución exitosa o el soporte mecánico necesario para promover el crecimiento de tejido nuevo en los sitios defectuosos. Sin embargo, las propiedades mecánicas de los andamios híbridos dependen del método de fabricación, el contenido, la orientación de los nanomateriales, la naturaleza de la matriz, las interacciones entre la matriz polimérica y los nanomateriales, etc21,29,57,58,59, 60

Se usaron diferentes composiciones de filamentos para la impresión 3D de andamios PLA/CNC usando FDM como se describe en la sección experimental. Se estudió el análisis del efecto de la celulosa sobre el módulo de Young, el límite elástico y la deformación a la rotura de los andamios impresos en 3D y los resultados se muestran en la Fig. 3. Los andamios de PLA tienen un módulo de Young medio de 2,4 ± 0,1 GPa de acuerdo con la bibliografía29,61 y un alargamiento medio a la rotura de 2,4 ± 0,3 %, mientras que el módulo de Young medio y el alargamiento a la rotura de los composites oscilan entre 2–3 GPa y 2–3,6 %, respectivamente. Esto está en buen acuerdo con las propiedades de los compuestos PLA/fibra natural62. Parece que la adición de un 3% de CNC mejora la resistencia mecánica del PLA (p ˂ 0,001). Esta mejora puede deberse a una mejor hibridación de partículas CNC en cadenas PLA para garantizar la mejor compatibilidad y absorber cualquier carga externa. De hecho, a una concentración relativamente baja de refuerzo celulósico, las interacciones moleculares entre PLA y CNC proporcionan una buena rigidez a los compuestos. Esto da como resultado una mejora en el módulo de Young63 de 2,4 ± 0,1 GPa para PLA a 3,1 ± 0,2 GPa para PLA/CNC3 porque a bajas concentraciones de CNC las partículas tienden a alinearse en la dirección de la orientación de las cadenas de PLA52. En consecuencia, la tensión aplicada se transfiere de una fibrilla a la siguiente dentro de la estructura compuesta, lo que permite una distribución uniforme de la tensión en el material. La mejora en el alargamiento a la rotura y las fuerzas de deformación a la rotura de los composites con refuerzo celulósico ≤ 3% sugiere que la presencia de CNC tiende a mejorar la elastoplasticidad del PLA. Esto podría resultar de la buena interacción fibra-matriz debido a un mejor enclavamiento de la red CNC en la matriz PLA. La incorporación de un 5% de CNC tiende a formar partículas de gran tamaño distribuidas en el composite, lo que se traduce en la formación de menores uniones entre la matriz (PLA) y el refuerzo (CNC) y una mala compatibilidad que se traduce en un mal comportamiento mecánico.

Propiedades mecánicas: (a) Foto de andamios PLA y PLA/CNCx en forma de hueso de perro para pruebas de resistencia a la tracción. (b) Módulo de Young. (c) Límite de elasticidad a la tracción. (d&e) tensión de rotura (***p ˂ 0,001, ** p < 0,01, ns = no significativo).

Con base en estos resultados, enfocamos los siguientes análisis solo en PLA/CNC3. De hecho, cuando el contenido de CNC es superior al 3 % (p/p), el PLA no puede humedecer suficientemente la superficie del CNC, lo que da como resultado una fuerte interacción fibra-fibra y/o aglomeración de fibras en la matriz PLA52,54. Sin embargo, Kumar et al.52 encontraron un aumento del 50 % en el módulo elástico (E) con 1 % de CNC (4550 MPa) en comparación con PLA puro (3030 MPa). El módulo elástico del PLA y sus compuestos fue mejor que el nuestro. Sin embargo, se observa una disminución de la deformación a la rotura para CNC al 1 % (2,8 %) en comparación con la muestra de PLA puro (8,7 %).

La morfología de la superficie de los andamios PLA y PLA/CNC3 se analizó mediante SEM, microscopía óptica 3D y topografía (Fig. 4). Estas imágenes muestran claramente que el andamio de PLA tiene una superficie lisa mientras que el de PLA/CNC3 es rugoso debido a la presencia de celulosa. Idealmente, los andamios impresos deberían tener poros del mismo tamaño. Sin embargo, el análisis de las imágenes SEM (Fig. 4) revela que el tamaño de poro del andamio híbrido (PLA/CNC3) aumentó mientras que el ancho de las varillas disminuyó de manera similar a lo informado en la literatura21,29. En nuestro trabajo, el tamaño de poro promedio y el ancho de la varilla de los andamios PLA y PLA/CNC3 se evalúan respectivamente en (362 ± 19 µm y 458 ± 17 µm) y (450 ± 15 µm y 337 ± 30 µm). Esta variación en la morfología de la superficie del andamio se puede atribuir a la modificación del comportamiento reológico de la matriz por la adición de CNC. De hecho, la adición de CNC podría limitar el comportamiento elástico del PLA y, por lo tanto, darle estabilidad para conservar su forma durante la deposición. Sin embargo, el refuerzo produce una inestabilidad del flujo de material durante la impresión afectando probablemente a la calidad y resolución.

Micrografías electrónicas de barrido de andamios impresos en 3D: vista superior de la morfología de (a) PLA y (c) PLA/CNC3. Sección transversal con un recuadro de acercamiento de (b) PLA y (d) PLA/CNC3. (g) Análisis estadístico de los diámetros de PLA y PLA/CNC impresos en 3D observados en la parte superior de las muestras mediante SEM (Test Anova, **p < 0,01). Topografía de andamios impresos en 3D que normalmente muestra la rugosidad de la superficie de (e) PLA y (f) PLA/CNC3.

Además, la porosidad es uno de los parámetros más críticos para evaluar la eficiencia y aplicabilidad de los andamios biomédicos, particularmente en ingeniería de tejido óseo, administración de fármacos, etc. Una porosidad alta promueve la liberación eficiente de biofactores, incluidas células, genes y proteínas, y proporciona un entorno propicio para el intercambio de nutrientes64,65. La porosidad de los andamios PLA y PLA/CNC3 es relativamente alta (58 ± 2 % y 67 ± 2 %), respectivamente. La adición de 3% de CNC aumenta la porosidad de los andamios de PLA (**p ˂ 0.01), lo que se puede atribuir a la interacción iónica entre los diferentes componentes creando más vacíos en los andamios. Con dichos perfiles de porosidad, los andamios impresos podrían ayudar a mejorar el crecimiento óseo al permitir una vascularización óptima, la nucleación de hidroxiapatita y la maduración mineral66,67.

La hidrofilia es una propiedad que afecta significativamente la capacidad de adhesión, proliferación celular y rehidratación de los andamios; por lo tanto, parece crucial para el rendimiento de los andamios para cualquier aplicación en la ingeniería de tejidos, incluida la regeneración ósea. Por lo tanto, la reactividad y la interacción entre los andamios impresos y la superficie circundante podrían predecirse midiendo el ángulo de contacto y estudiando la hinchazón en el agua. La Figura S4 (consulte la Información complementaria) ilustra los ángulos de contacto con el agua de los andamios PLA y PLA/CNC3 y los valores se presentan en la Tabla 2. CNC aporta un carácter hidrofílico a la superficie hidrofóbica de los andamios PLA debido a la reorganización de CNC en la matriz PLA . Para comprender mejor el efecto del relleno de celulosa sobre la hidrofilia del PLA, evaluamos la tasa de absorción de agua de los andamios (Tabla 2). La adición de CNC conduce a una mejora en la absorción de agua de PLA de acuerdo con los resultados del ángulo de contacto y la rugosidad de la superficie de los andamios. Murphy et al.56 observaron resultados de retención de agua similares en filamentos de PLA y PLA/celulosa. Revelaron un aumento significativo en la absorción de agua durante las primeras 24 h seguido de una estabilización para alcanzar gradualmente una meseta (1,2 % para el filamento PLA y 1,4 % para el filamento compuesto de PLA/celulosa).

En vista de estos resultados, los andamios PLA/CNC son capaces de crear un entorno favorable para la proliferación celular y, por lo tanto, aparecen como los compuestos de elección para la regeneración ósea.

La degradación enzimática de los andamios biomédicos se examina de forma rutinaria determinando la pérdida de peso. En nuestro estudio, los andamios PLA y PLA/CNC3 se sometieron a un estudio de degradación in vitro sumergiéndolos en tampón alcalasa durante un período de 28 días. De acuerdo con los resultados que se muestran en la Fig. 5, parece que el andamio PLA tiene una degradación más lenta en comparación con el compuesto PLA/CNC3. De hecho, PLA y PLA/CNC3 tienen tasas de degradación evaluadas respectivamente en 1,7 ± 0,3 % y 3,9 ± 0,1 % después de 28 días de inmersión en el tampón de alcalasa. Por lo tanto, se consideran estables. La incorporación de CNC a la matriz PLA mejora relativamente la degradación del PLA. En comparación con los estudios realizados por Belaid et al.29 sobre andamios compuestos de PLA y óxido de grafeno (PLA/GO), la carga CNC conduce a una mejora moderada en la tasa de degradación de los andamios de PLA en tampón de alcalasa. Por lo tanto, CNC aparece como un refuerzo adecuado de PLA. Por lo tanto, el biocompuesto PLA/CNC puede diseñarse como un material potencial para desarrollar andamios que pueden usarse como sustitutos temporales, especialmente para la regeneración de tejido óseo. Los compuestos PLA/CNC podrían exhibir propiedades transitorias favorables al reabsorberse con el tiempo para proporcionar espacio para el tejido óseo recién formado que reemplazará el andamiaje en el cuerpo.

Pérdida de peso de andamios de PLA y PLA/CNC3 en función del tiempo de degradación (andamios sumergidos en tampón de alcalasa durante un período de 28 días). (**p ˂ 0.01 y ***p ˂ 0.001 utilizando un análisis de prueba t no apareado).

El proceso de mineralización biomimética de andamios impresos en SBF fue elegido para evaluar la formación de apatita en la superficie de PLA y PLA/CNC3 con el fin de concluir sobre su regeneración ósea y capacidad de unión. La Figura 6 muestra imágenes SEM de la superficie de andamios PLA y PLA/CNC3 después de 14 días de incubación en la solución SBF. El proceso de crecimiento mineral en la superficie de los andamios se logró con éxito mediante la formación de un recubrimiento bioactivo. Para todas las muestras se observa claramente la formación de una capa mineral no homogénea, reflejada en la distribución irregular de agregados de nanocristales en la superficie, cuyo tamaño y densidad dependen del tiempo de incubación y de la composición del andamio. Varios autores han observado resultados similares68,69,70,71,72,73. Las partículas minerales nucleadas en la superficie de los andamios tienen un aspecto de varilla. La mineralización de los cristales de apatita depende del pH del medio, la adsorción y liberación de iones en la interfase y la humectabilidad de la superficie71. En general, la mineralización aumenta con el tiempo de incubación y es mayor y más rápida para andamios PLA/CNC3. De hecho, la deposición de apatito en la superficie de PLA es relativamente lenta debido a su lenta hidrólisis en solución SBF69. La hidrólisis de PLA en solución SBF puede tardar varias semanas en formar nuevos grupos carboxilo (-COOH) e hidroxilo (-OH) en su superficie. Luego, los grupos carboxilo sufren una disociación parcial para dar iones carboxilato (COO-) en la superficie causando su carga negativa. La fuerte interacción electrostática entre los iones COO− y Ca2+, así como los fuertes enlaces de hidrógeno entre los grupos carboxilo y los iones PO43− impulsarán el proceso de acumulación de iones calcio Ca2+ y fosfato PO43−69,74.

Evaluación del crecimiento de apatita sobre andamios PLA y PLA/CNC3 mineralizados en SBF a los 14 días mediante microscopía electrónica de barrido a alto y bajo aumento (SEM) para validar la formación de la capa inorgánica y mediante mapeo elemental para mostrar la presencia y distribución homogénea de los elementos fosfato y calcio que constituyen la apatita. (a) imágenes SEM y mapeo elemental de PLA, (b) imágenes SEM y mapeo elemental de PLA/CNC3.

Por otro lado, podríamos especular que la adición de CNC a la matriz de PLA podría modificar el proceso de formación de la capa mineral debido a la hidrofilia resultante de la formación de grupos hidroxilo adicionales en la superficie de PLA. Estos grupos funcionales juegan un papel importante en el intercambio de iones entre la superficie y el líquido circundante y en la deposición de apatito en el andamio. De hecho, estos grupos de hidróxido traen cargas negativas adicionales a la superficie del andamio para interactuar con los iones Ca2+ y PO43− del SBF, promoviendo así la adsorción y la nucleación de apatito68,71,75,76. En vista de estos resultados, los compuestos PLA/CNC son buenos candidatos para apoyar la formación de apatita y, por lo tanto, contribuyen a la regeneración y unión ósea al proporcionar un microambiente conveniente para el crecimiento celular y la función de reparación.

La biocompatibilidad del andamio PLA/CNC se investigó usando osteoblastos humanos hFOB1.1977. En comparación con las células de control no tratadas (Ctrl), la incubación con filamentos PLA y PLA/CNC3 no mostró ningún efecto inhibitorio sobre la viabilidad celular en el día 5 (Fig. 7a), lo que confirma que PLA y CNC son citocompatibles.

Citocompatibilidad de filamentos y andamios PLA y PLA/CNC. ( a ) Efecto de los filamentos PLA o PLA / CNC3 sobre la viabilidad de los osteoblastos humanos hFOB en el día 5 de cultivo. (b) Microscopía electrónica de barrido que muestra células hFOB cultivadas en los andamios PLA (panel izquierdo) y PLA/CNC3 (panel derecho) (barra de escala = 200 µm). ( c ) Crecimiento de células hFOB luminiscentes en los andamios PLA y PLA / CNC3 en los días 1, 2 y 4. ( d ) Expresión de genes marcadores de diferenciación osteogénica en células hFOB cultivadas durante 2 días en presencia de eluatos de PLA y PLA / CNC3. El análisis estadístico se ha realizado mediante la prueba de Mann-Whitney entre PLA y PLA/CNC3 (ns, no significativo; ***, p < 0,001).

Para determinar que las células óseas podían adherirse y proliferar en los andamios correspondientes, realizamos microscopía electrónica de barrido después de sembrar la célula hFOB en los andamios. Como se muestra en la Fig. 7b, las células hFOB se extendieron por completo en los andamios PLA y PLA/CNC3 y exhibieron una morfología normal. Además, también sembramos células bioluminiscentes hFOB (línea celular osteoblástica) en los andamios y monitoreamos su crecimiento a lo largo del tiempo. Después de 6 días, los osteoblastos proliferan significativamente en ambos andamios y no se observaron diferencias significativas en el andamio PLA/CNC3 en comparación con PLA (Fig. 7c). Finalmente, evaluamos el efecto de PLA y PLA/CNC3 en la diferenciación de hFOB midiendo por RT-QPCR la expresión de genes (ALP, RUNX2 y OCN) utilizados como marcadores de diferenciación ósea. Como se muestra en la Fig. 7d, el nivel de expresión de los 3 genes fue mayor en presencia de PLA/CNC3 que en presencia de PLA solo. En conjunto, estos datos sugieren que los andamios PLA/CNC3 soportan completamente el crecimiento de células óseas y son biocompatibles.

En general, nuestro enfoque en el diseño de andamios biomiméticos 3D para la ingeniería de tejido óseo está de acuerdo con investigaciones anteriores que demuestran que el refuerzo de PLA con nanomateriales mejora las propiedades biológicas y mecánicas del material21,29. No obstante, los nanorrellenos existentes son sintéticos y podrían desencadenar efectos no deseados si se acumulan en los tejidos. Aquí, un biopolímero natural con respuestas biológicas relevantes, es decir, CNC, incorporado en la matriz de PLA en una cantidad óptima, mejora significativamente la resistencia mecánica del andamio sin alterar la porosidad y la estructura ajustables. Este es un parámetro clave para lograr la funcionalidad óptima de los andamios de tejido biomiméticos de última generación.

Los andamios PLA reforzados con nanocristales de celulosa se han diseñado y fabricado con éxito utilizando tecnología FDM. Se evaluaron sus propiedades estructurales, superficiales, morfológicas y mecánicas, así como su desempeño biológico. Los andamios celulares 3D son altamente porosos con la presencia evidente de una arquitectura porosa repetitiva interconectada favorable a la mejora del crecimiento del tejido óseo al permitir la vascularización óptima, la nucleación de hidroxiapatita y la maduración mineral. Una incorporación del 3 % (p/p) de CNC en el compuesto aumenta las propiedades mecánicas del PLA y la rugosidad de la superficie, al tiempo que contribuye a mejorar la humectabilidad mediante una transición superficial del PLA de hidrofóbico a hidrofílico. Se confirmó el proceso de mineralización de los andamios impresos utilizando fluido corporal simulado y la nucleación de hidroxiapatita. Finalmente, los compuestos PLA/CNC parecían totalmente compatibles con los osteoblastos humanos y permitían su adhesión y proliferación. Nuestros resultados arrojan luz sobre la relevancia de CNC en compuestos basados ​​en PLA para la ingeniería de tejidos y abren caminos simples y prometedores para diseñar andamios multifuncionales impresos en 3D que estén activos para futuras aplicaciones de regeneración de tejidos.

Los gránulos de ácido poliláctico (PLA) se adquirieron de NatureWorks LLC. Diclorometano (CH2Cl2, < 99,7 %, CAS 75-09-2, Sigma-Aldrich), hidróxido de sodio (NaOH, gránulos, 98,9 %, Sigma-Aldrich), ácido sulfúrico (H2SO4, 95,0–98,0 %, CAS 7664-93- 9, Sigma-Aldrich), peróxido de hidrógeno (H2O2, 30 % (p/p), CAS 7722-84-1, Sigma-Aldrich), etanol (96 % vol, CAS 64-17-5, Sigma-Aldrich), cloruro de sodio (NaCl, ≥ 99 %, CAS 7747-14-5, Sigma-Aldrich), carbonato ácido de sodio (NaHCO3, ≥ 99,7 %, CAS 144-55-8, Sigma-Aldrich), cloruro de potasio (KCl, ≥ 99 ,7 %, CAS 7447-40-7, Sigma-Aldrich), fosfato de hidrógeno dipotásico trihidrato (K2HPO4.3H20, ≥ 99 %, CAS 16788-57-1, Sigma-Aldrich) cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2.6H2O, ≥ 99 %, CAS 7791-18-6, Sigma-Aldrich), cloruro de calcio (CaCl2, ≥ 97 %, CAS 10043-52-4, Sigma-Aldrich), sulfato de sodio (Na2SO4, ≥ 99,0 %, CAS 7757-82 -6, Sigma-Aldrich), tris-hidroximetilaminometano ((HOCH2)3CNH2) (tris), ≥ 99,8 %, CAS 1185-53-1, Sigma-Aldrich), ácido clorhídrico (HCl, 36 % CAS 7647-01- 0, Sigma-Aldrich), Bacillus licheniformis (alcalasa, CAS 126741 Sigma-Aldrich), L-cisteína (CAS,52-90-4), Azida sódica (CAS 26628-22-8, Sigma-Aldrich), tampón TRIS pH 9.0 (CAS 77-86-1, Alfa Aesar), Dimetilsulfóxido (DMSO, CAS 23486.297; BDH Prolab), medio Eagle modificado de Dulbecco α (DMEM/F12, CAS 10565018; Gibco)), bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT, 98 %, CAS 298- 93-1, Sigma-Aldrich), suero bovino fetal (FBS, CVFSVF00-01; Eurobio), tripsina-EDTA (CAS 25300-054; Gibco), hexametildisilazano (CAS 999-97-3, Sigma-Aldrich). y utilizado sin purificación adicional. Se usó la línea celular osteoblástica hFOB obtenida de la ATCC para el análisis de citocompatibilidad.

Los nanocristales de celulosa (CNC) se sintetizaron a partir de Ficus thonningii (FT) mediante un método de tres pasos basado en (1) tratamiento con álcali, (2) blanqueo e (3) hidrólisis ácida según lo propuesto por Dingyuan Zheng78 con modificaciones. Brevemente, las fibras crudas de FT, previamente secadas y almacenadas a 70 °C, fueron cortadas, trituradas y luego dispersadas en una solución alcalina de hidróxido de sodio (NaOH, 0.5 N) con una relación fibra a solución de FTFs/NaOH de 3 g/80 mL. Se agitaron continuamente a 100 °C durante 4 h. Después del tratamiento con álcali, las fibras se filtraron, se lavaron con agua MilliQ 18 M hasta la neutralización del pH. Las fibras resultantes se blanquearon con peróxido de hidrógeno (H2O2) durante 1 h a 80 °C. La secuencia de blanqueo se repitió varias veces para obtener fibras de un blanco brillante. Finalmente, la síntesis de nanocelulosa se realizó mediante el proceso de hidrólisis ácida seguido de ultrasonidos. En detalle, se disolvieron 10 g de fibras blanqueadas en 200 g de una solución acuosa de ácido sulfúrico (64%) con agitación magnética durante 1 h 30 min a 45 °C. Luego, la suspensión obtenida se filtró, se lavó varias veces con agua MilliQ 18 M y luego se sometió a diálisis durante 7 días (en bolsas de diálisis de 12.000 a 14.000 Da). Después de la diálisis, la solución resultante se sonicó en un baño de hielo utilizando un homogeneizador ultrasónico (BANDELIN electronic, GM 3100) equipado con una punta de sonda de 7 cm. El rango operativo del homogeneizador ultrasónico se fijó en 50%. La suspensión resultante se centrifugó a 10 000 rpm durante 30 min y la pasta se congeló, liofilizó y luego se molió en un mezclador Moulinex (LM935) a 8 000 rpm durante 3 min para obtener un polvo blanco de nanocristales de celulosa (CNC). La figura S5 resume los pasos de la síntesis de nanocristales de celulosa a partir del tallo FT (consulte la información complementaria).

Para producir filamentos compuestos de PLA/CNC homogéneos mediante extrusión de un solo tornillo, inicialmente propusimos formular compuestos incorporando rellenos de nanocelulosa en la matriz de PLA mediante disolución química. Se disolvieron 30 g de PLA en 200 mL de diclorometano (DCM) a temperatura ambiente con agitación magnética continua seguida de sonicación en un baño de hielo durante 5 min. Luego, la suspensión de CNC/DCM se agregó a la de PLA para dar lodos de mezcla de PLA/CNC/DCM con 0, 1, 3 y 5 % (p/p) de CNC en relación con PLA (Tabla 3). Las suspensiones de PLA/CNC/DCM obtenidas se sonicaron en un baño de hielo usando un homogeneizador ultrasónico durante 15 min y se mantuvieron bajo agitación magnética continua a temperatura ambiente durante 24 h para asegurar una buena homogeneización. Luego se dejaron secar durante la noche a temperatura ambiente, luego se cortaron en trozos pequeños y se secaron al vacío durante 24 h para asegurar un secado completo. Los polímeros compuestos secos resultantes se extruyeron utilizando una extrusora de un solo tornillo Noztek modelo MHB26234 a un rango de temperatura de 160–165 °C. Luego se enfriaron por conversión en la salida de la boquilla usando el ventilador del extrusor para dar filamentos híbridos PLA/CNC denominados PLA/CNCx, donde x corresponde al contenido de CNC. Finalmente, se seleccionaron filamentos de aproximadamente 1,75 ± 0,05 mm de diámetro para la impresión 3D. Los filamentos de PLA puro se produjeron por extrusión directa a partir de palas de PLA en las mismas condiciones que los filamentos compuestos. La Figura 8 resume la preparación de filamentos compuestos PLA/CNC. La secuencia de extrusión se repitió de 2 a 3 veces para obtener filamentos PLA/CNCx de diámetros homogéneos. El andamio fue modelado por Computer Aided Design (CAD) utilizando el software Design Spark Mechanical, traducido a un archivo STL y cortado por el software Prusa3Dslicer para generar el código G. Finalmente, los diseños cilíndricos (porosos) (diámetro (10 mm) × altura (2 mm)) y las piezas rectangulares (densas) se diseñaron utilizando una impresora modelo FDM Prusa MK2S Research equipada con una boquilla de 0,4 mm de diámetro a 200 ºC Los filamentos se depositaron con una arquitectura de relleno recto en direcciones precisas de 0° y 90° entre dos capas sucesivas. El espesor de cada capa fue de 0,15 mm con un 80% de relleno para los cilindros y un 100% de relleno para las piezas rectangulares y la velocidad de impresión fue de 30 mm/s.

Pasos de fabricación del andamio PLA/CNCx (extrusión del filamento compuesto e impresión 3D).

Los compuestos PLA y PLA/CNCx se examinaron utilizando un calorímetro diferencial de barrido (DSC) (instrumentos Q20, TA), equipados con un sistema de refrigeración RCS90 (instrumentos TA). Las muestras se pesaron en una bandeja TA de aluminio y se sellaron. Se usó como referencia una bandeja sellada vacía. Las muestras se enfriaron primero a 25 °C y luego se calentaron a 250 °C con una velocidad de calentamiento de 20 °C min-1 en atmósfera de nitrógeno. Las propiedades térmicas de los compuestos PLA y PLA/CNCx, como la temperatura de transición vítrea (Tg), la temperatura de cristalización en frío (Tcc), la temperatura de fusión (Tm) y la entalpía de fusión (ΔHm) se evaluaron mediante escaneos de calentamiento. El grado de cristalinidad (\({\chi }_{c}\)) se determinó tanto para el pico de cristalización en frío como para el pico de fusión utilizando las siguientes ecuaciones56:

donde ΔHcc es la entalpía de cristalización en frío, W es la fracción en peso de PLA en la muestra y ΔHm0 es la entalpía de fusión para material PLA 100 % cristalino, que se tomó como 93 J g−1. El análisis termogravimétrico (TGA) se realizó con un equipo TGA Q500 (TA instrument). Se calentaron 10 mg de cada muestra bajo nitrógeno desde temperatura ambiente hasta 800 °C a una velocidad de calentamiento de 10 °C min−1.

La espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) se realizó en un modo de reflectancia total atenuada (ATR-FTIR) en un espectrómetro modelo NICOLET NEXUS. Todos los espectros se registraron en un rango espectral de 4000–650 cm−1 con una acumulación de 32 escaneos a una resolución de 4 cm−1.

La morfología de CNC, PLA extruido y filamentos compuestos, así como los andamios impresos en 3D, se observaron utilizando microscopía electrónica de barrido HITACHI S4800. Las muestras se recubrieron por pulverización catódica durante 30 s con platino usando un Mini Sputter Coater Polaron SC7620 para el análisis SEM. Se empleó el software Image J para calcular el diámetro medio del filamento tomando el promedio en 20 puntos y el tamaño de poro tomando el promedio de 8 poros, que se indica como media ± desviación estándar. La topografía de las superficies de los andamios se analizó mediante microscopía óptica 3D (Keyence) y un probador de rugosidad cromática confocal (STIL SA) equipado con un sensor CHR1000.

La porosidad del andamio se obtuvo por un método de desplazamiento líquido como se reporta en la literatura64. Brevemente, los andamios se sumergieron en tubos que contenían una cantidad específica de etanol (W1) durante 30 min. Luego, el peso total de andamios sumergidos y etanol se anotó como W2. Después de retirar los andamios, el etanol residual en los tubos se anotó como W3. La porosidad de los andamios se midió de acuerdo con la siguiente ecuación:

Las propiedades mecánicas de los andamios PLA/CNC impresos en 3D se caracterizaron utilizando un sistema de tracción (Zwick Roell), junto con una celda de carga de 5KN. Los especímenes se imprimieron en forma de hueso de perro (40 mm de largo, 4 mm de ancho y 1,5 mm de espesor). Luego, las muestras se sujetaron entre mordazas dedicadas y se tiraron a una velocidad de 0,05 mm s-1 hasta que se rompieron. El software de Zwick Roell es capaz de calcular el módulo de Young, la fuerza máxima de rotura y el alargamiento de rotura. Se imprimen al menos 5 muestras en las mismas condiciones para realizar una medición estadística.

Se examinó el ángulo de contacto de los andamios impresos en 3D con agua para determinar su hidrofilia a temperatura ambiente mediante el método de caída sésil. Se analizaron dos andamios: PLA como referencia y PLA/CNC3 como el composite con mejor rendimiento mecánico. Las gotas fueron fotografiadas usando un analizador Drop Shape—DSA25 equipado con una cámara monocromática B-CAM-21-BW (CCCIR) y una lámpara Led R60 (Conrad). Brevemente, se dejaron caer 6 μL de agua MilliQ 18 M sobre la superficie de cada andamio y se registró el ángulo de contacto en equilibrio (considerado a los 60 s). Se utilizaron los software One Touch Grabber e Image J para calcular los ángulos de contacto. El comportamiento de hinchamiento de los andamios se determinó por método gravimétrico. Los andamios de peso previamente conocido (Wd) se sumergen en 10 ml de agua MilliQ 18 M, luego se incuban con agitación continua a 37 °C durante un tiempo de equilibrio que se supone que es de 7 días. Luego las muestras se sacaron del agua, se limpiaron con papel filtro para eliminar el exceso de agua residual adsorbida en la superficie y se pesaron (Wh). Finalmente, el índice de hinchamiento del andamio se determinó de la siguiente manera:

La degradación enzimática de PLA y PLA/CNC3 se realizó utilizando la enzima alcalasa según un protocolo previamente reportado en la literatura con modificaciones29,79,80. De hecho, se imprimieron tiras de tejidos PLA y PLA/CNC3 (dimensiones 5 [W] × 15 [l] × 0,13 [h]) de aproximadamente 0,25 g y se sumergieron en 25 mL de tampón TRIS (pH 9,5, 60 °C) con una concentración óptima del 50 % (p/p) (en relación con el peso del tejido) de alcalasa necesaria para la hidrólisis enzimática, L-cisteína 3 mM y 0,05 % (p/p) de azida sódica (en relación con el peso del tejido). tampón TRIS). La degradación se evaluó determinando la pérdida de peso a los 4, 7, 14, 21 y 28 días. Las muestras se secaron primero a 105 °C durante 90 min, se enfriaron en un desecador y luego se pesaron en una botella de pesaje cerrada. El porcentaje de pérdida de peso se calculó de la siguiente manera:

donde W1 y W2 son el peso seco de las muestras antes y después de la biodegradación, respectivamente.

La línea de células osteoblásticas hFOB 1.19 (ATCC® CRL11372™, ATCC, EE. UU.)77 se cultivó usando medio condicionado DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium α) (Gibco 10565018) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% (V/V). ) (Eurobio CVFSVF00-01). Las células se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5 % en una placa de Petri de 10 cm de diámetro y se tripsinizaron con tripsina-EDTA al 0,05 % (Gibco 25300-054). Después de la esterilización con etanol al 70 % (p/v) durante 30 min e irradiación UV durante 1 h, los filamentos y los andamios impresos se secaron a temperatura ambiente y luego se pusieron en contacto con células hFOB durante 5 días.

La viabilidad celular se analizó mediante el ensayo de MTT llevado a cabo mediante la incubación de 100 µl de 0,5 mg/ml de solución de MTT en las células durante 3 h. Los cristales de formazán de color púrpura se disolvieron usando 100 µL de DMSO (BDH Prolab 23486.297) y la absorbancia se registró a 560 nm usando un lector Multiskan plat (thermos, EE. UU.).

Para los ensayos de adhesión, se cultivaron células hFOB 1.19 en los andamios durante 4 días (siembra de 2 × 104 células por pocillo de placa de 24 pocillos que contenía el andamio). Las células cultivadas en andamios se fijaron con una solución de glutaraldehído al 2,5 % durante 2 horas a temperatura ambiente. Luego, los andamios con células se incubaron dos veces durante 15 min a temperatura ambiente, usando concentraciones crecientes de etanol (30 %, 50 %, 70 %, 95 % (v/v)), seguido de etanol absoluto y luego hexametildisilazano durante la noche. Para los ensayos de crecimiento de andamios, se cultivaron células hFOB 1.19 que expresan luciferasa en andamios durante 6 días (siembra de 2 × 104 células por pocillo de placa de 24 pocillos que contiene el andamio). La actividad de luciferasa se cuantificó usando un luminómetro después de la lisis celular. Para investigar únicamente la influencia de la celulosa en las propiedades biológicas del PLA, se utilizó un modelo 2D.

Se sembraron células hFOB 1.19 a razón de 500 000 células/pocillo en placas de fondo plano de 6 pocillos y se incubaron a 37 °C/5% CO2 durante 48 h en 2 ml de medio previamente incubado durante 24 h con los andamios correspondientes a 0,2 g/ mililitros El ARN total se extrajo utilizando el EZNA Total RNA Kit I, siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc se sintetizó a partir de 1 µg de ARN mediante transcriptasa inversa (Mix qScript, Invitrogen Life Technologies). Las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador (LightCycler® 480) durante 30 ciclos. Los cebadores utilizados se proporcionan en la Tabla 4.

Para evaluar la bioactividad ósea, se estudió la capacidad de formar apatito en andamios PLA y PLA/CNC3 mediante cultivo mineralizado in vitro en fluido corporal simulado (SBF) según el método descrito en la literatura81. Brevemente, los andamios se sumergieron en 10 mL de SBF fresco y luego se incubaron en una incubadora termoplástica a 37 °C. La solución de SBF se cambió cada dos días durante el período de estudio de 4 semanas. Después de la incubación, se extrajeron muestras semanales del fluido y se secaron en un desecador. Finalmente, se llevaron a cabo microscopía electrónica de barrido (SEM) y espectroscopía de rayos X de dispersión de energía (Detector: Oxford Instruments X-Max AZTEC, Reino Unido; Microscopía: Zeiss EVO HD15, Alemania) para investigar el grado de mineralización de los andamios.

Para la mayor parte del método de caracterización cuantitativa, se utilizó la prueba ANOVA para evaluar si los datos de cada grupo de muestras mostraban una diferencia significativa (p < 0,05 para significativa). Para el ensayo de degradación, se realizó una prueba t no pareada para comparar los datos de PLA con PLA/CNC3. Para las pruebas biológicas se realizó la prueba de Mann-Whitney para el análisis estadístico.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementaria).

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Hélène Garay es reconocida por su apoyo en los análisis topográficos.

Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Educación Superior e Investigación Científica (MESRS) de la República de Costa de Marfil, la Agencia Nacional Francesa (ANR, programa JCJC, MONOME ANR-20-CE08-0009) y el proyecto IEM Ax Energy PAT (CeraLique Sólido).

Instituto Europeo de Membranas, IEM, UMR 5635, Univ Montpellier, ENSCM, CNRS, Montpellier, Francia

Kanga Marius N'Gatta, Habib Belaid, Joelle El Hayek, Nathalie Masquelez, Mikhael Bechelany y Chrystelle Salameh

Laboratorio de Termodinámica y Fisicoquímica Ambiental, UFR SFA, Universidad Nangui Abrogoua, 02 BP 801, Abidjan 02, Costa de Marfil

Kanga Marius N'Gatta, Edja Florentin Assanvo y David Boa

IRCM, Instituto de Investigación del Cáncer de Montpellier, INSERM U1194, Universidad de Montpellier, 34298, Montpellier, Francia

Habib Belaid, Marilyn Kajdan y Vincent Cavaillès

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Correspondencia a Chrystelle Salameh.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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N'Gatta, KM, Belaid, H., El Hayek, J. et al. Impresión 3D de compuestos basados ​​en nanocristales de celulosa para construir andamios biomiméticos robustos para la ingeniería de tejido óseo. Informe científico 12, 21244 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25652-x

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Recibido: 13 junio 2022

Aceptado: 02 diciembre 2022

Publicado: 08 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25652-x

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